Determining the effects of DOT1L interacting proteins on cellular reprogramming

Abstract

Tamamen farklılaşmış hücreler ektopik transkripsiyon faktörleri ile uyarılmış plüripotent kök hücrelere (uPKH) yeniden programlanabilmektedir. Fakat bu hücre kaderi değişiminin arkasında yatan mekanizma hala tam olarak açıklanamamıştır. Embriyonik gelişim sürecinde olduğu gibi somatik hücre yeniden programlanmasında da epigenetik düzenleyicilerin büyük rolü bulunmaktadır. Bundan önce, Histon H3 lizin 79 metiltransferazı olan DOT1L'in susturulması durumunun, soya özgü genleri düzenleyerek yeniden programlama verimini arttırdığı gösterilmiştir. DOT1L, kromatine çağırılarak bir dizi diğer kromatin düzenleyiciler ile uyum halinde hareket etmektedir. Fakat bu tip DOT1L-etkileşimli proteinlerin yeniden programlama üzerindeki rolü halen bilinmemektedir.Bu tezin ilk kısmında, DOT1L-yakınsal proteinleri biyotinlemekle görevli, seçici olmayan BirA ligazı (BirA*) içeren BioID metodu kullanılarak; özgün DOT1L-etkileşimli proteinler in vivo olarak belirlenmiştir. Biyotinlenen proteinler Streptavidin ile çöktürülüp LC-MS/MS ile tanılanmıştır. Elde edilen özgün DOT1L-etkileşimli protein adaylarının yeniden programlama üzerindeki etkileri incelenmiştir. İnsan fibroblast hücrelerinde shRNA'lar ile aday genlerin ifadeleri baskılanıp bu hücreler yeniden programlanmıştır. Elde ettiğimiz sonuçlar, AF10'un (MLLT10) baskılanmasının uPKH oluşum verimini arttırdığını ve yeniden programlama üzerinde DOT1L'e benzer şekilde bariyer görevi olduğunu göstermektedir. Bu bulgu, CRISPR/Cas9-aracılığıyla AF10'un susturulması ile de doğrulanmıştır. DOT1L-baskılanması ve AF10-susturulması durumlarının bir arada uygulanmasıyla, ek bir artışın görülmemesi, bu iki kromatin faktörünün aynı yolakta etkili olduğunu akla getirmektedir.Bu tezin ikinci kısmında, bilinen DOT1L'e doğrudan ve işlevsel bağlanan proteinler literatürden belirlenerek, bu genlerin yeniden programlama üzerindeki etkileri işlevsel kayıp deneyleri ile incelenmiştir. RNA interferans veya CRISPR/Cas9 ile Mixed Lineage Leukemia (MLL1) ifadesinin baskılanması yeniden programlama verimini arttırmıştır. MLL1'in yeniden programlamayı nasıl engellediğini belirlemek için, RNA-dizileme analizi yapılmıştır. MLL1'in baskılanması fibroblastlara-özgü genlerin baskılanması ve plüripotentlere-özgü genlerin etkinleşme hızında ivmelenme ile sonuçlanmıştır.Bir arada ele alındığında, bu çalışma iki önemli kromatin belirleyicisinin yeniden programlama üzerinde bariyer olarak davrandığını ortaya çıkarmış ve hücre kimliğinin devamlılığını sağlayan epigenetik mekanizmaları anlamamıza katkı sağlamıştır.

Fully differentiated cells can be reprogrammed into induced pluripotent stem cells (iPSCs) by ectopic expression of transcription factors. However, the mechanism behind this cell fate change is not fully elucidated. Epigenetic regulators have important roles during embryonic development as well as somatic cell reprogramming. Previously, it has been shown that inhibition of DOT1L, the histone H3 lysine 79 methyltransferase, increases the efficiency of reprogramming via regulation of lineage specific genes. DOT1L is recruited to chromatin and act in concert with a number of additional chromatin regulators. However, the role of such DOT1L-interacting proteins in reprogramming remains unknown. In the first part of this thesis, novel DOT1L interactors were identified using the BioID method in which a promiscuous BirA ligase (BirA*) was employed to biotinylate DOT1L-proximal proteins, in vivo. Biotinylated proteins were pulled-down by Streptavidin and identity of the proteins was determined by LC-MS/MS. The resulting novel interaction candidates were investigated for their effects on reprogramming. Candidate genes were knocked-down in human fibroblasts via shRNAs followed by reprogramming. Our results indicated that knock-down of AF10 (MLLT10), significantly increased the iPSC generation efficiency, suggesting that it acts as a barrier to reprogramming similar to DOT1L. This finding was verified by CRISPR/Cas9 mediated knockout of AF10. Combining DOT1L inhibition or knockout with AF10 suppression did not result in an additive enhancement of reprogramming, suggesting that these two chromatin factors act in the same pathway. In the second part of this thesis, known direct and functional interactors of DOT1L were curated from the literature and their effects on reprogramming was investigated through loss of function experiments. Suppression of Mixed Lineage Leukemia 1 (MLL1) expression via RNA interference or CRISPR/Cas9 significantly increased reprogramming efficiency. To determine how MLL1 prevents reprogramming, RNA-sequencing was performed. MLL1 suppression resulted in downregulation of fibroblast-specific genes and accelerated the activation of pluripotency-related genes. Taken together, this study uncovered two important chromatin factors that act as barriers to reprogramming and contributed to our understanding of epigenetic mechanisms that maintain cell identity.