Bruselloz tanısında iki farklı polimeraz zincirleşme yöntemini kullanımı

Abstract

Brusella cinsi bakterilerin neden olduğu bruselloz, pek çok ülkede olduğu gibi ülkemiz için de önemli bir halk sağlığı sorunu olan zoonozdur. Özgül olmayan şikayetler ve bulgularla seyreden hastalığın tanısında altın standart olan kültürde bakteriyi üretmek oldukça zor ve zaman alıcıdır. Rutinde daha sık kullanılan serolojik yöntemlerin ise diğer proteinlerle olan çapraz reaksiyonlardan dolayı özgüllüğü düşüktür. Polimeraz zincirleşme reaksiyonu (PZR) gibi moleküler yöntemler pek çok infeksiyon hastalığı gibi brusellozun erken ve hızlı tanısında iyi bir alternatif yöntem olmaktadır.Bu çalışmada, brusellozun erken tanısı ve maliyet etkinliği yönlerinden iki farklı PZR yönteminin konvansiyonel yöntemlerle karşılaştırılması amaçlandı.Çalışma, K.Ü.T.F. İnfeksiyon Hastalıkları ve Klinik Mikrobiyoloji A.D. polikliniğine başvuran bruselloz ön tanılı 35 hasta (Grup 1) ve 20 sağlıklı gönüllüden (Grup 2) oluşturuldu. Gruplardan serolojik çalışma (SAT, Coombs) için serum, PZR için tam kan (EDTA'lı tüplere) alınırken, hastalardan ateşli oldukları dönemde kan kültürleri alındı. Tam kan örneklerinden elde edilen lökosit pelletlerinden DNA izolasyonu yapıldı ve hem in house hem de real time PZR (RT-PZR) yöntemleriyle brusella DNA'sı çalışıldı.Grup 1'deki hastaların SAT değeri 1 olguda 1/80 iken, diğerlerinde ? 1/160 idi. Bunların 16'sında kan kültürü pozitif bulundu. Grup 2'de ise SAT değerleri negatif idi. Nested PZR yöntemiyle yapılan çalışmada hastaların %97'sinde, RT-PZR `de ise % 57 oranında pozitiflik saptanırken, her iki yöntemde de kontrollerin hepsi negatif bulundu. Her iki yöntemde de özgüllük % 100 bulunurken, RT-PZR'de duyarlılığın düşük olmasının kullanılan farklı primerlere veya ekstraktların saklama şartlarına bağlı olabileceği düşünüldü. Kullanılan nested PCR yönteminin erken ve hızlı tanıda yüksek duyarlılıkta olduğu, aynı şekilde RT-PZR'ye göre daha duyarlı ve ucuz olduğu; bu nedenle brusellozun erken ve doğru tanısı için kullanılmasının doğru olacağı sonucuna varıldı.

Brucellosis is a public health problem in our country like many parts of the world. The illness is a zoonosis caused by Brucella spp. and has non specific symptoms and physical signs. Bacterial culture is gold standard in the diagnosis of brucellosis but it is difficult and time consuming, so serologic techniques are used routinely. But they have low specificity because of the cross reactions. Molecular methods like polymerase chain reaction (PCR) are good alternatives in the early and rapid diagnosis of brucellosis, like other infectious diseases.The aim of this study is to use two different PCR methods in diagnosis of brucellosis and compare their efficiency and cost with conventional methods.The study included 35 patients who referred to Kırıkkale University Medical Faculty, department of Infectious Diseases and Clinical Microbiology with symptoms and laboratory findings of brucellosis (Group-1) and 20 healthy volunteers (Group-2). Sera for serology (SAT, Coombs test) and whole blood samples (collected in tubes with EDTA) for PCR were collected from each subject in both groups and two blood cultures were done for all patients in Group-1. DNA was extracted from peripheral mononuclear cells obtained from the blood samples and in house and real time PCR assays were used to detect brucella DNA.SAT titers of patients in Grup-1 were ? 1/160 except one patient that was 1/80. Blood cultures were of 16 patients were positive. The SAT titers of Group-2 were negative. Thirty-four (97%) of the patients in Group-1 had positive nested PCR results, while 20 (57%) were positive with RT-PCR. None of the 20 volunteers in Group-2 were positive with both methods. The low sensitivity we found with RT_PCR may be partly explained by primer used or inadequate preservation of the leukocyte pellets (4 months at ?20°C) before RT-PCR assay. Nested PCR has high sensitivity and it has low-priced when compared with RT-PCR; therefore it may be used in rapid diagnosis of brucellosis.