Türev spektrofotometrisi ile sistein varlığında sistin tayini

Abstract

V. ÖZET TÜREV SPETROFOTOMETRİSİ İLE SİSTEİN VARLI?INDA SİSTİN TAYİNİ Bu çalışmada herhangibir reaktife gerek, olmaksızın sistein yanında sistin tayini amaçlanmıştır. Her iki amino asidin 1. türev spektrumları alındığında sistin spektrumunda yeralan 265 nm'deki minimumun bu amaç için uygun olduğu görülmüştür. Sistein'in yüksek konsantrasyonlarında bu dalga boyunda sistein içinde l.türev absorbans değerleri okunduğundan çeşitli konsantrasy onlardaki sistin ve sistein çözeltileri kullanılarak yapılan denemeler sonucunda 4.0x10` M (96 ppm) mertebesinde sistin miktarının bunun 25 katı (1.0xlO`2M) sistein varlığında duyarlı olarak herhangi bir reaktife gerek olmaksızın pek çok araştırma laboratuvarında bulunan türev alma fonksiyonuna sahip bir spektro fotometre ile saptanabileceği bulunmuştur. Proteinlerin hidrolizi sonucu yaygın olarak elde edilen 20 amino asitten diğer 17'sinin de (hidroksiprolin hariç) etkileri incelenerek sistin'in 4.0x1ü`4 M (96 ppm) konsantrasyona karşılık gelen miktarının treonin, glisin, serin, glutamik asit, arginin, histidin, lösin, izolösin, alanin, lizin, valin, prolin ve aspartik asidin yüksek konsantrasyonlardaki (250 kat, lösin ve aspartik asit için 125 kat) varlığından etkilenmeden duyarlı ve basit bir şekilde saptanabileceği sonucuna varılmıştır. Metiyonin'in 1.0xlO`2M yani 25 kat fazla bulunmasının bir etkileşime yolaçmadığı, daha yüksek konsantrasyonlarının ise pozitif hataya neden olduğu, fenilalanin, triptofan ve tirozin'in ise 10 M mertebesindeki konsantrasyonlarda dahi bozucu etkisi bulunduğu saptanmıştır. 49Fenilalanin ve tirozin'in bu etkilerinin bunların 2.türev spektrumlarmda fenilalanin için 265 nm, tirozin için ise 283 nm'de görülen maksimumlarından miktarlarının belirlenip 265 nm'deki l.türev absorbans değerinden karşılık gelen değerleri çıkarmak suretiyle ortadan kaldırılabileceği bulunmuştur. Triptofan için ise 1. ve 2. türev spektrumlarmda diğer amino asitlerle çakışmayan herhangi bir pik saptanamamıştır. Yöntemin sütten elde edilen (3-laktoglobulin hidrolizatma uygulanmasıyla sistin konsantrasyonu 0.267 g/100 g bulunmuştur. Bu değerin P-laktoglobulin'in amino asit içeriğinde sistin için verilen literatür değerinden (2.3 g/100 g) oldukça düşük olmakla beraber Cu (ll)-neukoproin yöntemi ile bulunan 0.324 g/100 g değeri ile uyumlu olduğu görülmüştür. 50

SUMMARY DETERMINATION OF CYSTINE IN THE PRESENCE OF CYSTEINE BY DERIVATIVE SPECTROPHOTOMETRY This study aims to determine cystine in the presence of cysteine without requiring any reagent. Investigation of the first-derivative spectra of both amino acids revealed that the minimum at 265 nm of the cystine spectrum was suitable for devising an analytical method. This first-derivative minimum due to cystine was tested in solutions containing much higher concentrations of cysteine, and as a result, cystine could be determined down to a concentration limit of 4.0x10` M (96 ppm) in the presence of 25-fold cysteine (1.0x10` M) without the use of any reagent, and the proposed procedure may find potential usage in most conventional laboratories having a spectrophotometer equipped with the first - derivative function. Out of the 20 amino acids which emerge as a result of protein hydrolysis, the possible interfering effects of 17 amino acids (with the exception of hydroxyproline) were analyzed when 4.0x1 0`4M (96 ppm) of cystine was determined. It was concluded that cystine could be simply and sensitively determined without any interference when 250-fold threonine, glycine, serine, glutamic acid, arginine, histidine, alanine, lysine, valine, proline, isoleucine and 125-fold leucine, aspartic acid were present. Methionine did not interfere up to a concentration, limit of 1.0x10` M (25 fold) but caused positive error above this 51limit. On the other hand, phenylalanine, tryptophan and tyrosine interfered even at 10`4 M concentrations. The interference due to phenylalanine and tyrosine could be eliminated by quantitative estimation of these two amino acids using their second-derivative maximal absorbances at 265 nm. and 283 nm, respectively, and by subtraction of their corresponding first-derivative absorbances at 265 nm from the observed total value of a cystine solution containing these two interferent amino acids. No peak could be identified in either the first - or second - derivative spectra of tryptophan that did not coincide with those of other amino acids. The developed method was applied to the analysis of P-lactoglobuline hydrolyzate isolated from milk yielding a cystine content of 0.267 g/100 g Although this value is quite lower than the literature value, i.e., 2.3 g/100 g it is roughly accordance with that (0.324 g/100 g) found by the Cu (Il)-neocuproine spectrophotometric procedure. 52