Cicer arietinum l.`de doku kültürlerinin kurulması ve gen transfer sistemlerinin optimizasyonu

Abstract

Bu çalışmada, Cicer arietinum L. cvs. Kırmızı nohut, Canıtez 87 ve MB- 10 varyetelerinde etkin doku kültürü ve gen transfer sistemleri kuruldu. Gövdeyi veren olgun embriyo ucu eksplant olarak alındı. MS+0.1 mg/1 NAA ve 0.5 mg/1 2,4-D içeren besiyerinde kallus, MS+ 0.2 mg/1 IAA+ 0.5 mg/1 Kn ve 0.2 mg/1 6-BAP içeren besiyerinde bitki rejenerasyonu elde edildi. En iyi rejenerasyon yanıtını MB- 10 varyetesi verdi (%85). pBI-121 plazmitlerini içeren A. tumefaciens 4404 ve A. rhizogenes 9402 suşları ile gövde eksplantlarının ko-kültivasyonundan sonra eksplantlar MS+100 mg/1 Cx + 1 mg/1 2,4-D+l mg/1 Kn ve MS+100 mg/1 Km ve MS+100 mg/1 Cx +100 mg/1 Km içeren seçici besiyerlerinde kültüre alındı. Kültürler 16 saat ışık / 8 saat karanlık periyodunda, 25°C,de kontrollü bitki büyütme kabininde tutuldular A. tumefaciens uygulanmış gövdelerde taç tümör, bitkicik ve A. rhizogenes uygulanmış gövdelerde ise saçak kökler elde edildi. Bitkicik ve saçak köklerden izole edilen DNA'larda GUS ve NPT II genlerinin varlığı Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile incelendi. Çoğaltılmış DNA'lar Southern Blot ile nitroselluloz membruna alınarak Digoksigcnin sistemi ile işaretlendi ve transformasyon ınolcküler dfl/eyde kanıtlandı. En iyi transformasyon yanıtı A. tumefaciens ile Canıtez 87'de (%12.7), A. rhizogenes ile ise MB-10 (%10.4) varyetesinde gözlendi. 47

In this study, an efficient tissue culture and gene transfer systems of Cicer arietinum L. cvs. Red chickpea, Canitez 87 and MB- 10 varieties were established. The explants were taken from the shoot-apex part of the mature embryo. For callus induction MS + 0.1 mg/1 NAA + 0.5 mg/1 2,4-D and for plant regeneration MS + 0.2 mg/1 IAA + 0.5 mg/1 Kn + 0.2 mg/1 6-BAP containing media were used. Best regeneration response was taken from the MB-1 0 variety (85 %). After co-cultivation of shoot explant with A. tumefaciens 4404 and A. rhizogenes 9402 both containing pBI-121plasmids. Explants were cultured on selective media; MS+100 mg/1 Cx + 1 mg/1 2,4-D+l mg/1 Kn+100 mg/1 Km for A tumefaciens 4404 and MS +100 mg/1 Cx +100 mg/1 Km. for A.rhizogenes. Cultures were kept in a controlled growth cabinet at 16 hours light / 8 hours dark periods, at 25°C incubation. Explant co-cultivated with A. tumefaciens produced crown gall and plantlets on selective media. However, applications with A. rhizogenes produced hairy roots. The existence of GUS and NPT II genes on the DNA, isolated from plantlets and hairy roots, were investigated with Polymerase Chain Reaction. Amplified DNA that was taken to the nitrocellulose membrane by Southern Blot, was hybridized by Digoxigenin system and transformation was confirmed at the molecular level. The best transformation response of planlets was in Canitez 87 (%12.7) with A. tumefaciens and MB- 10 variety (%10.4) with A. rhizogenes. 48