Sanicula europaea L. ekstrelerinin influenza virus infeksiyonlarına etkileri

Abstract

V, TÜRKÇE ve İNGİLİZCE ÖZETLER V.l. ÖZET Sanicula europaea L. Ekstrelerinin Influenza Virus İnfeksiyonlanna Etkileri Bu çalışmada, MDCK hücre kültürlerinde Sanicula europaea L. ekstraktlarımn influenza viruslarına (influenza A/PR/8/34, A/Vic/1/75 ve B/Lee/40) karşı antiviral aktiviteleri araştırıldı. Bu amaçla Sanicula europaea L. bitkisinin yaprak ve rizomlarından ham ekstreler hazırlandı. Bu ekstreler jel filtrasyon kolon kromatografisi ile farklı fraksiyonlara (yapraklardan Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IV; rizomlardan FrİR, Fr.IIR, Fr:IIIR, FrlViO ayrıldı. Aynı zamanda, Sanicula europaea L.'den aseton ekstraksiy onundan sonra elde edilen ham ekstre de jel filtrasyon kolonundan geçirilerek fraksiyonlandı (FrİA, Fr.IIA, Fr.IIIA). Tuz çözeltisi ile gerçekleştirilen bir seri elüsyonun dışında tüm ekstraksiyon ve kromatografik elüsyon işlemleri distile su ile gerçekleştirildi. Yaprak ham ekstraktı amonyum sülfatla çöktürme ile de ayrıştırıldı (Fr(o/o2o), Fr(%60), Fr(o/ol0o)). Ham ekstrelerin ve ham ekstrelerden elde edilen farklı fraksiyonların antiviral aktiviteleri belirlenmeden önce MDCK hücreleri için toksisiteleri test edildi. Fraksiyonların çoğunun (Fr.IV, Fr.IIIA ve Fr.IVR hariç) 100 jiıg/ml konsantrasyona kadar MDCK hücreleri için toksik olmadığı görüldü. Tüm fraksiyonlar daha yüksek konsantrasyonlarda (300 u,g/ml ve üzerinde) MDCK hücreleri için toksik bulundu. Bu nedenle daha sonra gerçekleştirilen tüm antiviral aktivite testlerinde ekstraktlar, 100 fig/ml konsantrasyona kadar kullanıldı. Ekstrelerin antiviral aktiviteleri ekstre varlığında viral replikasyonun inhibisyonu olarak ortaya kondu. Ekstre varlığında viral replikasyonun inhibisyonu ; a) plak inhibisyon testi, b) hemaglutinasyon testi, c) virusidalaktivite testi ve e) in vitro vRNA polimeraz aktivitesi testi kullanılarak belirlendi. Plak inhibisyon testleri Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr(o/o2o), Fr(o/o60), Fr.IIR ve Fr.IIIR'nin influenza A/PR/8/34'e karşı çok aktif olduğunu (100 (ig/ml konsantrasyonda % 95-98 plak inhibisyonu), oysa ekstre varlığında influenza A/Vic/l/75'in mikroskopik plaklar oluşturduğunu gösterdi. Bununla birlikte aynı fraksiyonların influenza B/Lee/40'a karşı etkili olmadığı görüldü. Diğer taraftan, influenza A/PR/8/34 ve influenza B/Lee/40 ile infekte olmuş hücrelerde, ekstre varlığında ve ekstre yokluğunda virus çoğalması hemaglutinasyon testleri ile de belirlendi. Bu testler sonucu elde edilen bulgular ekstrelerin virus adsorbsiy onunu etkilemediğini gösterdi. Virusidal aktivite testleri ekstrelerin antiviral aktivitelerinin direkt virusidal etkiden kaynaklanmadığını ortaya koydu. Hemaglutinasyon testleri ve virusidal aktivite tesleri ile elde edilen sonuçlar, plak inhibisyon testleri ile ortaya konan Sanicula europaea L. ekstraktlarının antiviral aktivitesinin viruslarm direkt inaktivasyonlan ya da viruslarm hücrelere adsorbsiyonları ile ilişkili olmadığını gösterdi. Elde edilen bu sonuçlara bağlı olarak, influenza A/PR/8/34 ve A/vic/l/75'e karşı Sanicula europaea L. ekstrelerinin gösterdiği antiviral aktivitenin, konak hücre içerisinde viral replikasyonla ilgili olabileceği söylenebilir. Bu nedenle, in vitro vRNA sentez sisteminde in vitro viral RNA polimeraz aktivitesi test edildi. Bu sistemde influenza A/PR/8/34 viral RNA polimeraz aktivitesinin Sanicula europaea L. ekstraktı ile tamamen inhibe olduğu görüldü. 100 ug/ml konsantrasyonda Sanicula europaea L. ekstraktı ile influenza A/PR/8/34 vRNA sentezinin tamamem inhibe olması, ekstrelerin antiviral aktivitesinin vRNA sentezinin inhibisyonu ile ilgili olabileceğini göstermektedir.

V.2. SUMMARY The Effects of Sanicula europaea L. Extracts on Influenza Virus Infections In this study, the antiviral activity of Sanicula europaea L. extracts on influenza viruses (Influenza A/PR/8/34, A/Vic/1/75 and B/Lee/40) was investigated in MDCK cell culture conditions. For this purpose crude extracts were prepared from Sanicula europaea L. leaves and rhizomes. Different fractions were separated from these extracts through gel filtration chromatography [Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IV (from leaves) and Fr.IR, Fr.IIR, Fr.IIIR, Fr.IVR (from rhizomes)]. Crude extracts obtained after acetone extraction of Sanicula europaea L. leaves were also separated through gel filtration chromatography (Fr.IA, Fr.IIA, Fr.IIIA). Except one series of elution with salt solution, all extraction and chromatographic elution procedures were performed with distillated water. Some fractions from the crude extract of the leaves were separated with ammonium sulphate precipitation (Fr(o/o20), Fr(o/o60), Fi`(%ioo))- Before testing the antiviral activity, crude extracts and different fractions separated from the crude extracts were tested for their toxicity in MDCK cells. Most fractions (except Fr.IV, Fr.IIIA and Fr.IVR) were found non-toxic for MDCK cells up to 100 fig/ml concentration. All fractions were found toxic for MDCK cells at higher concentrations (300 jug/ml or more). Therefore, in all our subsequent antiviral activity tests the extracts up to 100 (ig/ml concentration were used. Antiviral activity of the extracts was determined as the inhibition of viral replication in the presence of the extract. Inhibition of the viral replication in the presence of the extract was determined by; a) plaque inhibition test, 71b) hemagglutination test, c) virucidal activity test and d) in vitro vRNA polymerase activity test. Plaque inhibition tests showed that Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr(%2o), Fr(o/o60)5 Fr.IIR and Fr.IIIR are very active against influenza A/PR/8/34 (95-98 % plaque inhibition at 100 p,g/ml concentration) while influenza A/Vic/1/75 produced only microscopic plaques in the presence of extracts. However, the same fractions were not active against influenza B/Lee/40. Secondly, in the cultures infected with influenza A/PR/8/34 and influenza B/Lee/40, viral growth was determined using hemagglutination tests in the presence or absence of the extract, and the results showed that adsorbtion of the viruses was not affected by the extracts. Virucidal activity tests also showed that antiviral activity of the extracts was not related to direct virucidal effect. Results obtained using hemagglutination test and virucidal activity test showed that antiviral activity of the Sanicula europaea L. extracts determined by plaque inhibition tests is not related to the inhibition of adsorbtion or direct inactivation of the virus by the extract. According to these results the antiviral activity of the Sanicula europaea L. extracts against influenza A/PR/8/34 and A/Vic/1/75 may be related to the inhibition of viral replication inside the host cell. For this reason, in vitro viral RNA polymerase activity was tested in an in vitro viral RNA synthesis system. In this system, influenza A/PR/8/34 viral RNA polymerase activity was completely inhibited by Sanicula europaea L. extract. The complete inhibition of influenza A/PR/8/34 vRNA synthesis by Sanicula europaea L. extract at the concentration of 100 ug/ml indicates that the antiviral activity of extracts is related to the inhibition of vRNA synthesis. 72