BALB/c farelerde D-Galaktozamin/tümör nekroz faktör-alfa ile oluşturulan karaciğer hasarında apoptoz ve katepsin B`nin rolü

Abstract

Karaciğer hasarı oluşturmak amacıyla farelere farklı dozlarda D-galaktozamin ve tümör nekroz faktör-alfa (D-GalN/TNF-a) verilmesi karaciğer hastalıklarının patogenezini ve tedavisini incelemek amacıyla yaygın olarak kullanılan deneysel bir metodtur. D- Galaktozamin/TümÖr Nekroz Faktör-a ikilisinin uygulanması sonucu baskın olarak apoptotik hücre ölümü ile karakterize edilen yaygın karaciğer hasarı oluştuğu bilinmektedir. Katepsin B, D-GalN/TNF-a birlikteliği ile oluşan apoptotik hücre ölümü mekanizmasında önemli rol oynayabileceği düşünülen bir sistein proteinazdır. Benziloksikarbonil-L-Fenilalanin-L-Alanin-Florometilketon (Z-FA-FMK) ise, katepsin B ile ilgili araştırmalarda kullanılan bir katepsin B inhibitörüdür. Bu çalışmanın amacı, farelerde D-GalN/TNF-a ile oluşturulan karaciğer hasarının, apoptotik ölümün ve hücre çoğalmasının hücresel mekanizmasında katepsin B'nin rolünün histolojik, immünohistokimyasal ve biyokimyasal olarak araştırılmasıdır. Çalışmada kullanılan BALB/c erkek fareler dört gruba ayrıldı. Birinci grup fizyolojik tuzlu su verilen bireylerden, ikinci grup sadece Z-FA-FMK verilen kontrol bireylerden, üçüncü grup D-GalN/TNF-a verilen bireylerden ve dördüncü grup hem D-GalN/TNF-a hem de Z-FA-FMK verilen farelerden oluşturuldu. 8 mg/kg Z-FA-FMK intravenöz olarak uygulandıktan 1 saat sonra, D-GaIN (700 mg/kg) ve TNF-a (15 ug/kg)'mn intraperitonal olarak enjekte edilmesi ile karaciğer hasarı oluşturuldu. Kesitler, Hematoksilin-Eosin ve Masson'un üçlü boyası ile boyandı. İn situ DNA uç işaretlemesi (TÜNEL) yöntemi apoptotik hücrelerin saptanması için, Streptavidin-Biyotin- Peroksidaz tekniği ise immünohistokimyasal metod olarak kaspaz-3 ve bölünen hücrelerin nukleus antijeni (PCNA) nin gösterilmesi için, parafin kesitlere uygulandı. Homojenize edilen karaciğer dokusu örneklerinde, glutatyon, lipid peoksidasyonu ve DNA düzeyleri biyokimyasal olarak tayin edildi. D-Galaktozamin/Tümör Nekroz Faktör-a verilen deney grubu bireylerinde, karaciğer dokusunda dejeneratif değişiklikler, TÜNEL ve kaspaz-3 pozitif hepatosit sayısında artma, PCNA pozitif hepatosit sayısında azalma, lipid peroksidasyon düzeyinde artma, glutatyon ve DNA düzeyinde azalma gözlendi. Oysa, D-GalN/TNF-a ve Z-FA-FMK verilen deney grubunun bireylerinde karaciğer dokusundaki histolojik hasarda azalma, TÜNEL ve kaspaz-3 pozitif hepatosit sayısında azalma, PCNA pozitif hepatosit sayısında artma, lipid peroksidasyon düzeyinde azalma, glutatyon ve DNA düzeyinde artma gözlendi. Yapılan mikroskobik ve biyokimyasal değerlendirmelerin sonuçlan, katepsin B'nin D- GaIN/TNF-a ile oluşturulan karaciğer hasarında ve TNF-a aracılı apoptotozda önemli bir rol oynadığını göstermiştir.

Administration of D-galactosamine and tumor necrosis factor-alpha (D-GaIN/TNF-a) in different doses for liver injury to mice, is a prevelant experimental method, which is used to examine the pathogenesis and treatment of liver diseases. It is well known that inducement of a massive liver damage, which is characterised by a dominant apoptotic cell death, by administration of D-GaIN/TNF-a combination, is posssible. Cathepsin B is a systeine proteinase, considered to have an important role on the apoptotic cell death mechanism, which is activated by D-GaIN/TNF-a combination. Z-Phe-Ala-FMK is a cathepsin B inhibitor used in researches on cathepsin B. The aim of this study is to investigate the role of cathepsin B on the cellular mechanism of apoptotic cell death, cell proliferation and the liver damage induced by D-GaIN/TNF-a combination in mice histologically, immunohistochemically and biochemically. In this study, the BALB/c male mice were divided into four groups. The first group were given only physiologic saline, the second group were administred only Z-Phe- Ala.FMK, the third group were received D-GaIN/TNF-a, and the fourth group were given both D-GaIN/TNF-a and Z-Phe-Ala-FMK. After 1 hour administration of 8 mg/kg Z-Phe-Ala-FMK by intravenous enjection, the liver damage was induced by the intraperitoneal injection of D-GaIN (700 mg/kg) and TNF-a (15 ng/kg). The sections were stained by Hematoxyline-Eosin and Masson's triple dyes. The in situ terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labelling (TUNEL) method was applied to paraffine sections in order to determine the apoptotic cells. The Streptavidin- Biotin-Peroxidase technique was applied to the paraffine sections as the immunohistochemical method for caspase-3 and the proliferating cell nucleus antigen (PCNA). The glutathione, lipid peroxide and DNA levels were determined in the homogenized liver tissue samples, biochemically. In the experimental group given D-GaIN/TNF-a, the degenerative changes in the liver tissue, an increase in the number of both TUNEL and caspase-3 positive hepatocytes, a decrease in the number of PCNA positive hepatocyte, an increase in the lipid peroxidation levels, a decrease in the glutathione and the DNA levels were observed. In contrast, it was seen in the experimental group given D-GaIN/TNF-a and Z-Phe-Ala- FMK that, a decrease in the histological damage on the liver tissue, a decrease in the number of both TUNEL and caspase-3 positive hepatocytes, an increase in the number of PCNA positive hepatocytes, a decrease in the lipid peroxidation levels, an increase in the glutathione and the DNA levels were determined. As a result, the microscopic and biochemical evaluations indicate that cathepsin B has an important role on the TNF-a mediated apoptosis, cell proliferation and liver injury induced by D-GaIN/TNF-a.