Transgenik embryo üretimi için koç spermatozoonlarının farklı yöntemlerle transfekte edilmesi

Abstract

Transgenik çiftlik hayvanlarının üretim amaçları kısaca genetik kodların yorumlanması, fizyolojik sistemlerin genetik kontrol çalışmaları, insan hastalık modellerinin oluşturulması, ksenotransplantasyon çalışmaları, hayvanlardan rekombinant proteinlerin eldesi, hayvan üretim özelliklerinin iyileştirilmesi, yeni hayvansal ürünlerin eldesi ve hastalıklara karşı dirençli hayvanların üretilmesi olarak sayılmaktadır.Çalışmanın amacı, koyunlarda spermatozoa aracılığı ile transgenik hayvan üretimi için tercih edilen yöntemlerden en uygununu belirlemek ve bu yöntemle transgenik embriyo elde etmektir. Bu amaçla çalışmada elektroporasyon, soğutma, Triton X-100 ile membran hasarı, LipofectaminTM kullanımı ve bu yöntemlerin dışında koç spermatozoası ile transgenik hayvan üretiminde kullanımına literatür taramalarında rastlanılmamış olan bazı maddeler transfeksiyon amacıyla kullanılmış ve belirli bir ölçüde transfeksiyon sağlanmıştır. Turbofect?, LDH ve Poli-ß-aminoesterler gibi taşıt maddeler ile yapılan ön denemelere göre bazı modifikasyonlar yapılıp DNA yüklenmiş spermatozoa kullanılarak ICSI yöntemi ile oositlerin fertilizasyonu gerçekleştirilmiştir. Embriyolardaki transgenik kontroller, marker gen olan GFP geni kullanılmasından dolayı floresan ataçmanlı invert mikroskopta yeşil ışıma gösterme durumlarına göre gerçekleştirilmiştir. Çalışmada elde edilen embriyoların transgeniklik ve transgenik etkinlik açısından gruplar arasında bulunan farklar incelendiğinde 2 numaralı elektroporasyon grubunun diğer gruplardan istatistiksel açıdan önemli (p<0,05) derecede daha iyi, 8 numaralı soğutma grubundan ise istatistiksel açıdan önemli olamamasına (p>0,05) rağmen bölünen embriyolar üzerinden yüzde orana bakıldığında daha yüksek bulunduğu, transgenik etkinlik açısından 8. grup hariç diğer gruplardan anlamlı bir fark (p<0,05) ile çok daha üstün bulunmuşturAnahtar Kelimeler : SMGT, Koyun, GFP, ICSI, Transgenezis

The purposes of generating transgenic farm animals are interpreting genetic codes, genetical control of physiological systems, forming human disease models, xenotransplantation, producing recombinant proteins from animals, bettering animal generating properties, getting new animal products and generating resistent animals to diseases. The aim of the study is to determine the most suitable technique for generating transgenic animal with spermatozoa and acquiring transgenic embryos with this technique in sheeps. Transfection is attempted with electroporation, cooling, membrane defect with Triton X-100, lipofectamine usage, the substances that are not reported in literatures for generating transgenic animals with ram spermatozoa. A particular degree of transfection is managed when transport materials like Turbofect?, LDH ve Poli-ß-aminoesters are used. According to preattempts some modification is made and using DNA loaded spermatozoa oocyte fertilization is carried out with ICSI technique. The controls of transgenic embryos are achieved according to the green luminescence status under fluorescent attached invert microscobe because of using the GFP marker gene. When the differences between the groups are examined with respect to being transgenic and transgenic efficiency of the embryos, electroporation group 2 is statistically quite better (p<0,05) than other groups except of the cooling group 8,with the difference is not statistically important (p>0,05), but the percent of the dividing embryos are more than the other groups.