Reaktif oksijen türleri kaynaklı oksidatif DNA hasarının modifiye CUPRAC yöntemi kullanılarak incelenmesi

Abstract

Oksijenli solunum yapan bir canlı olarak insan vücudunda reaktif oksijen ve azot türleri (sırasıyla ROS ve RNS) olarak adlandırılan bir takım oksidan maddeler gerek vücudun doğal işleyişi sırasında gerekse dış etkenlerle sürekli olarak oluşmaktadır. Bu maddelerin ortak özellikleri vücuttaki lipid, protein ve nükleik asitlere zarar vermesidir. Kanserojen ya da mutajen olarak bilinen bu türler genellikle kararlı olmadıklarından doğrudan tayin edilmeleri zordur. Bu anlamda oksidatif DNA hasarının belirlenmesinde, reaktif türlerin hücre çekirdeği ya da mitokondride bulunan DNA'ya saldırması sonucu oluşan çeşitli ürünlerden yararlanılır. Bunlar arasında en yaygın olanlar 8-hidroksiguanin (8-OHG) ve 8–hidroksi-2'-deoksiguanozin (8-OHdG) dir. 8-OHdG tayininde sıklıkla kullanılan analitik teknikler HPLC-MS ve GC-MS dir. Ancak bu yöntemlerin uygulanmasında pahalı teknik donanım ve uzman operatörlere ihtiyaç duyulmaktadır. Yapılan çalışmada DNA hasarının ölçülmesinde modifiye CUPRAC yöntemi uygulanmıştır. CUPRAC Yöntemi önce gıdalarda daha sonra ise biyolojik ortamlarda toplam antioksidan kapasite (TAC) tayini amacıyla kullanılmış olup daha sonra çeşitli amaçlarla kullanılmak üzere modifiye edilmiştir. Bu sayede salisilat probu kullanılarak hidroksil radikallerinin tayini ve çeşitli antioksidanların radikal süpürme etkinliklerinin incelenmesi gerçekleştirilmiştir. Yapılan çalışmada salisilat probu yerine DNA kullanılarak, DNA Fenton Yöntemi ile oluşturulan hidroksil radikallerince oksidatif hasara uğratılmış ve elde edilen oksidasyon ürünlerine modifiye CUPRAC yöntemi uygulanmıştır. Burada DNA'nın kendisi CUPRAC reaktif değilken elde edilen oksidasyon ürünleri CUPRAC reaktifi ile reaksiyon verebilmektedir. Çalışmada DNA hasarı sonucunda oluşan ürünlerin miktarının belirlenmesinde standart madde olarak 8-OHdG den yararlanılmıştır. Deneysel koşullar optimize edildikten sonra reaksiyon ortamına radikal süpürücü olarak seçilen antioksidan çözeltileri eklenmiş ve antioksidanların radikal süpürme etkinlikleri nedeniyle oluşan DNA hasar ürünlerinde azalma belirlenmiştir. Modifiye CUPRAC Yöntemi ile belirlenen DNA'nın oksidatif hasarı daha önce literatürde yer almış olan ve benzer temelle dayanan bir başka spektrofotometrik yöntem ile kıyaslanmıştır. Bu yönteme göre DNA nın uygun koşullar altında Fenton Reaktifi ile üretilen hidroksil radikalleri ile oksidatif hasara uğratılması sonucu oluşan ürünler TBARS Yöntemi (Tiyobarbütirik asit reaktif maddeler `Thiobarbituric acid reactive substances`) ile belirlenmiştir. Yapılan denemelerde Fenton Yöntemiyle oksidasyonunun ardından son konsantrasyonu 0,003 ile 0,03 mg mL-1 arasında değişen miktarlarda DNA'ya Modifiye CUPRAC Yöntemi uygulanmış ve kalibrasyon doğrusu çizilmiştir. Bu kalibrasyon doğrusu için belirlenen doğru denklemi A = 37,512 × CDNA (mg mL-1) + 0,164 olup R² değeri 0,9699'dur. TBARS Yönteminde ise 0,017 mg mL-1 – 0,087 mg mL-1 arasında değişen miktarlarda DNA için benzer şekilde elde edilen doğrunun denklemi A = 5,0123 × CDNA (mg mL-1) + 0,2527 olup R² değeri 0,9666'dır. TBARS ve Modifiye CUPRAC yöntemleri arası korelasyonu sağlamak için son konsantrasyonları 0,017 mg mL-1 – 0,087 mg mL-1 aralığında değişen DNA'ya iki yöntem uygulanmıştır. Daha sonra CUPRAC absorbansları x eksenine TBARS absorbansları y eksenine konularak iki yöntem arasındaki lineer korelasyon incelenmiştir. Bu yöntem ile elde edilen doğrunun R² değeri 0,9799 olarak belirlenmiş olup iki yöntemin birbiriyle yüksek bir korelasyon gösterdiği belirlenmiştir.

As an aerobic organism, different oxidants called as reactive oxygen and nitrogene species (ROS and RNS, respectively) generate continuously either via body's natural functions or by external factors. As a common feature these substances damage to lipids, proteins and nucleic acids in the body. Because of these species, which are known with their carciogenic and mutagenic properties, are unstable and it is hard to assess them directly. In this sense, on determination of oxidative DNA damage, various products resulting in the attack of reactive species to nucleic or mitochondrial DNA are utilized. The most common of these are 8-hydroxy guanine (8-OHG) and 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG). Commonly used analytical techniques for determination of 8-OHdG are HPLC-MS and GC-MS. However, to apply these methods, expensive technical equipment and specialized operators are needed. In this study, for measurement of DNA damage the modified CUPRAC method was applied. CUPRAC was used for determining total antioxidant capacity (TAC) firstly in food and then later in biological media, then the method was modified to use various purposes. Thus, the determination of hydroxyl radicals and investigation of radical scavenging effects of some antioxidants was conducted by using salicylate probe. In this study by using DNA instead of salicylate probe, DNA was damaged oxidatively by means of hydroxyl radicals produced through Fenton Method. Herein while DNA isn't CUPRAC reactive itself, obtained oxidation products can react with CUPRAC reactive. In the study, in determination of the amount of products resulting from DNA damage, 8-OHdG was used as the standard substance. After optimization of experimental conditions selected antioxidants were added to the reaction medium as radical scavenger and the decrease in the DNA oxidation products due to radical scavenging activities of them was determined. The DNA damage which has been determined by Modified CUPRAC Method was compared with another spectrophotometric assay based on a similar principle and previously described in the literature. According to this method the products resulting from oxidative damage of DNA by hydroxyl radicals produced with Fenton reaction under suitable conditions were determined through TBARS (thiobarbituric acid reactive substances) method. In the experiments after oxidation through Fenton method, the modified CUPRAC method was applied to varying amounts of DNA in a final concentration of between 0.003 and 0,03 mg mL-1 and a calibration graph was drawn. The calculated equation of the calibration graph is A = 37.512 × CDNA (mg mL-1) + 0.164 with R²=0.9699. Whereas for TBARS method a calibration graph was drawn similarly for different amounts of DNA in a final concentration between 0,017 - 0,087 mg mL-1 and for this graph calculated equation is A = 5,0123 × CDNA (mg mL-1) + 0,2527 with R²=0,9666. To find the correlation between two methods, TBARS and Modified CUPRAC methods were applied to varying amounts of DNA in a final concentration of between 0.017 and 0,087 mg mL-1.Then correlation between the two methods were investigated by putting Modified CUPRAC Method absorbances in x-axis and TBARS Method absorbances in y axis. The R² value was calculated as 0,9799 for the graph drawn as described above and it was determined that the two methods showed a high correlation with each other.