Lactococcus garvieae`de virulans genlerinin moleküler karakterizasyonu

Abstract

Bu tez çalışmasında laktokokkosiz etmeni olan Lactococcus garvieae suşlarının moleküler düzeyde tür doğrulaması gerçekleştirildi ve virulansın moleküler mekanizması genomik düzeyde araştırıldı. Bakteri suşlarının antibiyotik duyarlılık profilleri de belirlendi. Yurdumuzdaki ticari alabalık çiftliklerindeki hasta balıklardan izole edilmiş 19 L. garvieae suşu, bir insan patojeni ve bir referans ATCC 43921 suşu çoğaltım temelli analiz edildi. İlk olarak 21 L. garvieae suşunun 16S rRNA geni türe özgün primerler kullanılarak PZR ile çoğaltıldı. 21 suş ile gen bankasında kayıtlı Lg2 NC_017490.1 referans suşu arasında yüksek dizi homolojisinin varlığı nükleotid dizi hizalamaları ile belirlendi. Tüm suşlar tür düzeyinde L. garvieae olarak doğrulandı.Üç hemolizin (hly1, hly2, hly3) ve dokuz adezin geni (adhPav, adhPsaA, LPxTG-1, LPxTG-2, LPxTG-3, LPxTG-4, adhCI, adhCII, adh) tüm suşların genomik DNA'larından PZR analizi kullanılarak tarandı. Ek olarak, Streptococcus pneumonie virulans genlerinin (purB ve SP_0121) L. garvieae genomunda varlığı ilk kez bu çalışma ile araştırıldı. hly2 (796 bç), adhPsaA (522 bç), LPxTG-1 (947 bç), adhCI (490 bç) ve purB (864 bç) genlerinin tüm suşlarda taşındığı bulundu. Geriye kalan hly1 (522 bç), hly3 (549 bç), adhPav (1048 bç), LPxTG-2 (767 bç), LPxTG-3 (231 bç), adhCII (732 bç), adh (398 bç) ve SP_0121 (966 bç) genlerinin bazı izolatlarda var olduğu, diğerlerinde bulunmadığı belirlendi. Ek olarak, beklenen 1021 bç boyutlu LPxTG-4 gen fragmenti suşlardan çoğaltılamadı. Çalışma sonuçları L. garvieae suşlarının genomlarından çoğaltılan genlerin bakteri virulansında esansiyel olabileceğini gösterdi. Buna karşın, suşlar arasında polimorfik olarak taşınan genlerin ilgili bakteri virulans faktörlerini kodlayabilecekleri ancak kodlamadıkları belirlendi. Bu nedenle, bu genlerin patogeneze doğrudan katılmadıkları düşünülmektedir. Ayrıca, purB ve SP_0121 genlerinin L. garvieae'nin virulansından sorumlu olabileceği ilk defa gösterildi.Antibiyogram testleri tüm L. garvieae suşlarının ampisiline duyarlı iken klindamisin ve streptomisine dirençli olduğunu ortaya koydu. Eritromisin, florfenikol, kanamisin, enrofloksasin, siprofloksasin, kloramfenikol, oksitetrasiklin, sulfametoksazol-trimetoprim, flumekuin hassasiyeti değişen oranlardaydı. Antibiyotiklere karşı direçli suş yüzdesi %5-83 aralığında değişmektedir. Antibiyogram test sonuçlarına göre bakterilerin orta duyarlı ve hassas olduğu antibiyotikler terapötik ajan olarak kullanım potansiyeline sahiptir.Virulans genlerinin belirlenmesi L. garvieae'nin patojenitesinin anlaşılmasında önemlidir. Karakterize edilen bu virulans genleri bakteriyel patojenlerine karşı mücadelede yeni terapötik ve aşıların geliştirilmesinde dikkate alınmalıdır.

In this thesis study, the confirmation of Lactococcus garvieae strains which are causative agent of lactococcosis were carried out at molecular level and molecular mechanism of virulence were investigated at genomic level. Antibiotic susceptibility profiles of bacterial strains were also determined. Nineteen L. garvieae strains, which were isolated from diseased fish in commercial fish farms of our country, as well as one human patogen and the reference strain ATCC 43921 were analyzed based on gene amplification approach. At first, 16S rRNA genes of 21 L. garvieae strains were amplified by PCR using species-specific primers. Presence of high sequence homology among 21 strains and reference strain Lg2 NC_017490.1, registered in GenBank, were detected via alignments of nucleotide sequences. All strains were confirmed as L. garvieae at species level. Three hemolysin (hly1, hly2, hly3) and nine adhesin genes (adhPav, adhPsaA, LPxTG-1, LPxTG-2, LPxTG-3, LPxTG-4, adhCI, adhCII, adh) were screened from genomic DNAs of all strains using PCR analysis. Additionally, the presence of Streptococcus pneumonie's virulence genes (purB and SP_0121) in L. garvieae genome were investigated for the first time, in this study. It was found that hly2 (796 bç), adhPsaA (522 bç), LPxTG-1 (947 bç), adhCI (490 bç), and purB (864 bç) genes were carried in all strains. The presence of remaining hly1 (522 bç), hly3 (549 bç), adhPav (1048 bç), LPxTG-2 (767 bç), LPxTG-3 (231 bç), adhCII (732 bç), adh (398 bç) and SP_0121 (966 bç) genes were detected in some of the isolates whereas others had not. In addition, LPxTG-4 gene fragment with expected 1021 bp size could not be amplified from any strains. Results of the study revealed that the genes amplified from genomes of all L. garvieae strains can be essential for virulence of bacteria. However, it was detected that the genes which were carried polymorphically among strains could have coded the virulence factors of bacteria. Therefore, it was thought that these genes did not directly participate in pathogenesis. Moreover, it was specified that purB and SP_0121 genes might be responsible for virulence of L. garvieae, for the first time.Antibiogram tests indicated all L. garvieae strains are susceptible to ampicillin while resistant to clindamycin and streptomycin. The sensitivity of erythromycin, florfenicol, kanamycin, enrofloxacin, ciprofloxacin, chloramphenicol, oxytetracycline, sulfamethoxazole-trimethoprim, flumequine were at varying rates. The percentage of resistant strains aganist antibiotics ranged from 5 to 83%. According to the antibiogram test results, antibiotics which bacteria were intermediate or sensitive to has potential usage as a therapeutic agent.The determination of virulence genes is important in understanding the pathogenecity of L. garvieae. Characterized virulence genes should be also considered for the development of new therapeutics and vaccines in the struggle against bacterial pathogens.