Bitki hastalığı tespiti için ilmiğe dayalı izotermal çoğaltma yönteminin optimizasyonu

Abstract

Bitki hastalıkları, dünya genelinde düşük tarımsal verimliliğin en önemli nedenlerinden biridir. Bu hastalıkların yayılma oranları göz önünde bulundurulursa, gıda arzının sürdürülebilirliğinin önemli bir tehdit altında olduğu görülmektedir. Küresel tarım verimliliğindeki %40'a yakın kayba doğrudan patojenler, hayvanlar ve yabani otlar neden olmaktadır. Bitkilerin hastalıklara karşı tepkileri birbirlerinden farklıdır ve gösterdikleri tepkilerde çoğu zaman enfeksiyonu almalarından çok sonra ortaya çıkar. Bu nedenle enfeksiyonları henüz semptomlar oluşmadan tespit etmek büyük salgınların dolayısıyla da ekonomik kayıpların önüne geçecektir.Bitki hastalıklarını tespit edebilmek için yaygın olarak kullanılan laboratuvar bazlı birçok nükleik asit ve protein tanı yöntemi mevcuttur. Ancak çoğu tanı yönteminin uygulanması için kompleks cihazlara ve uzman kişilere gereksinim duyulmaktadır. Bu durum, bitki hastalıklarının hızlı ve sahada tanısına yönelik geliştirilecek yöntemlerin önünde engel oluşturmaktadır. 2000 yılında yayınlanan bir çalışma ile nükleik asit tabanlı tanı yöntemleri yeni bir boyut kazanmıştır. İlmiğe dayalı izotermal amplifikasyon (LAMP) olarak adlandırılan bu yöntemde, primerlerin tasarım biçimi ve kullanılan Bst DNA polimeraz enzimi nedeniyle bütün reaksiyon izotermal olarak gerçekleştirilebilmektedir. Bu da yöntemin, sahada kullanıma uygun tanı yöntemlerinin gelişmesi için son derece uygun olduğunu göstermektedir. Bu tez çalışmasında, patates bitkisi üretimine, küresel boyutlarda zarar veren Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus patojeninin tespiti için LAMP metodunun optimizasyonu gerçekleştirilmiştir. LAMP ürünlerinin tespiti için, jel elektroforez yöntemi, SYBR green yöntemi, bulanıklılık tespit yöntemi, kalsein boyama yöntemi, yanal akışlı test stripleri (LFD), kolorimetrik LAMP yöntemi gibi birçok yöntem kullanılabilmektedir. Bu tez çalışmasında ise jel elektroforez yöntemi, yanal akışlı test stripleri ve kolorimetrik LAMP yöntemi kullanılmıştır. Süre ve kullanım kolaylığı açısından yanal akışlı test stripleri ve kolorimetrik LAMP yönteminin, saha çalışmalarına daha uygun olduğu sonucuna varılmıştır.Yöntemin optimizasyonu gerçekleştirildikten sonra, Solanum tuberosum, Escherichia coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens ve Staphylococcus aureus DNA örneklerinde LAMP primerlerinin özgüllüğü test edilmiştir. Sonuçlar doğrultusunda tasarlanan primerlerin farklı bir patojen varlığında pozitif sonuç vermediği belirlenmiştir. Tanı konulması amacıyla kullanılması gereken en düşük DNA miktarının ya da diğer bir deyişle yöntemin hassasiyetinin 10 pg/µl DNA olduğu belirlenmiştir. Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus'un tanısı için optimizasyonu yapılan LAMP yönteminin, gerekli validasyon ve sertifikasyon çalışmalarının ardından saha çalışmalarında aktif olarak kullanılabileceği düşünülmektedir.

The most important causes of low agricultural productivity worldwide are plant diseases. Considering spread rate of these diseases, sustainability of food supply is a serious threat. Loss about 40% of global agricultural productivity is because of pathogens, animals and weeds. Reactions of plants to diseases are different from each other, and their first reactions are generally seemed much later than their first exposure to infection. For this reason, detecting of infections before symptoms are formed will prevent major outbreaks and economic losses.There are many laboratory-based methods of nucleic acid and protein diagnosis in order to detect plant diseases. On the other hand most of these diagnosis methods need complex equipments and experts. This situation is an obstacle to the methods to be developed for rapid diagnosis in the field of plant diseases.Nucleic acid based diagnosis methods got a new dimension with a study that published in 2000. In this method, called loop-mediated isothermal amplification (LAMP), whole reaction can be performed in isothermal conditions because of design features of primers and Bst DNA polymerases enzyme. This situation shows that, LAMP method has an important role in development of diagnostic methods suitable for using in the field studies.In this thesis, the LAMP method has been optimized for the detection of pathogenic microorganism Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus that damages potato plants in global dimensions.In order to detect LAMP products, gel electrophoresis method, SYBR Green method, turbidity detection method, calcein staining method, lateral flow test strips and colorimetric LAMP method are being used. In this thesis study, gel electrophoresis method, lateral flow test strips and colorimetric LAMP method have been used. In terms of time and ease of use, lateral flow test strips and colorimetric LAMP method are considered to be more suitable for field studies.After optimization of the method, the specificity of LAMP primers has been tested with DNA samples of Solanum tuberosum, Escherichia coli, Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens and Staphylococcus aureus. In the direction of the results, it has been determined that the designed primers do not give a positive result in the presence of a different pathogen. It has been determined that the minimum amount of DNA to be used for diagnosis, or in other words the sensitivity of method, is 10 pg/µl. The LAMP method that is optimized for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, is considered to be actively used in field studies after necessary validation and certification studies.