Kemik greft materyalin ve oksidatif stresin in vitro modelde fibroblastlar üzerindeki etkisi ve resveratrolün koruyucu rolü

Abstract

Yeni kemik oluşumunu desteklemek için özellikle diş hekimliğinde, ortopedi ve rekonstrüktif cerrahide kemik grefti çok tercih edilen bir materyaldir. Ti-oss® greft- (G) son yıllarda kullanılmaya başlanmış bir ksenogrefttir. İn-vitro iyileşme modelinde G ve ortamdaki oksidatif stresin-(OS), 3T3 fibroblast hücreleri üzerindeki etkisinin ve resveratrolün-(RES) potansiyel koruyucu rolünün incelenmesi amaçlanmıştır. G, H2O2, ve RES için doz ve zaman belirleme deneyleri yapıldı. Proliferasyon değerlendirilmesi popülasyon katlanma zamanı-(PDT) ve bromodeoksiuridin-(BrdU) işaretlemesiyle yapıldı. OS seviyesi floresan işaretlemeyle, Image-J programında değerlendirildi. Denemeler sonucunda 1mg/ml G, 500µM H2O2 ve 1µM RES dozlarıyla deney grupları oluşturuldu, 48 saat sürelerde PDT, BrdU ve OS aktiviteleri değerlendirildi. H2O2 ile inkübasyon sonucunda PDT indekslerinin yükseldiği görüldü, RES'le kombine edilince azalmalar kaydedildi. BrdU immünoreaktivitesi 1µM-RES ve 1mg/ml-G gruplarında en yüksek orandaydı. H2O2 gruplarında proliferasyon düşüşü izlendi ancak RES uygulamasıyla dengelendiği gösterildi. G, RES ve G+RES gruplarında herhangi bir OS artışına rastlanmadı üstelik RES'in OS düzeylerini azalttığı görüldü. Ayrıca deney gruplarında RT-PCR ile kolajenin COL1A2 tipinin ekspresyonu ve hücre migrasyonu (24saat) incelendi. En yüksek COL1A2 ekspresyonu H2O2+G+RES grubunda görüldü. H2O2 grubu migrasyon açısından karşılaştırıldığında, H2O2 G dışındaki tüm grupların hareketleri anlamlı derecede yüksek bulundu. 3T3-hücrelerinden elde edilen sferoitler transmisyon elektron mikroskobunda-TEM ultrastrüktürel olarak incelendi. G grubunda normal strüktüre sahip hücreler izlenirken, H2O2 uygulanan hücrelerde hasar tespit edildi, RES uygulamasıyla H2O2 tarafından oluşturulan ultrastrüktürel değişikliklerde düzelmeler izlendi. Ti-oss® greft materyalin fibroblastlar ile biyouyumlu olduğu, OS'te RES ile kombine uygulanmasının OS'i azalttığı, proliferasyon, migrasyon ve kolajen sentezini ise artırarak iyileşme sonuçlarını olumlu yönde etkilediği sonuçlarına varılmıştır.Anahtar Kelimeler: Kemik grefti, Oksidatif stres, Resveratrol, Fibroblast, İn-Vitro

Bone grafts are preferable materials in dentistry, orthopedics and reconstructive surgery to support new bone formation. Ti-oss®-graft-(G) as xenograft has been used in recent years. We aimed to investigate the effects of G and oxidative stress-(OS) on 3T3-fibroblasts and potential protective role of resveratrol-(RES) in an in-vitro healing model. Dosage and time assays were performed for G, H2O2 and RES. Proliferation was assessed by population doubling time-(PDT) and bromodeoxyuridine-(BrdU) staining. OS levels was evaluated by fluorescence staining and calculated in Image-J program. Experimental groups were established as 1mg/ml-G, 500µM-H2O2 and 1µM-RES doses. After 48-hour application, PDT, BrdU and OS activities were determined. PDT index increased in H2O2 incubation and decreased whith RES combination. The highest levels of BrdU-immunoreactivity were observed in 1µM-RES and 1mg/ml-G groups. H2O2 weakened proliferation index were stabilized whith RES application. There was no increase in OS levels of any groups of G, RES and G+RES combination. RES application decreased OS levels. In addition, the expression of COL1A2-collagen, was evaluated by RT-PCR and 24 hour-cell migration was calculated in experimental groups. H2O2+G+RES group indicated the highest COL1A2 expression. All groups showed good migration quality except H2O2 and H2O2+G groups. Spheroids of all experimental groups were evaluated ultrastructurally in TEM. G-group had normal ultrastructure while cells treated with H2O2 were damaged which was improved by RES. We concluded that Ti-oss® graft is biocompatible with fibroblasts; combination with RES decreases OS levels and improves the healing process increasing proliferation index, migration and collagen synthesis.Keywords: Bone graft, Oxidative stress, Resveratrol, Fibroblast, In-vitro