vgb+ Rekombinant E. coli Suşu ile mikrobiyal kondroitin sülfat üretimi

Abstract

Bu tezde; kendine özgü özellikleri nedeniyle tıpta, veterinerlikte, farmasötik ve kozmetik alanında çeşitli uygulamalara sahip, glikozaminoglikan türevli bir ürün olan kondroitin sülfatın (KS) bilinen hayvan kaynaklarının yerine güvenilir biyoteknolojik yöntemler kullanılarak yeni ve rekombinant bir mikrobiyal kaynaktan üretimi amaçlanmıştır.Çalışma kapsamında; öncelikle vgb genini taşıyan pUC8:15 plazmidinin, E. aerogenes [pUC8:15] suşundan izole edilip çoğaltılması sağlanmıştır. Daha sonra, uygun işlemler ile vgb gen bölgesi pETM6-PACF plazmidine aktarılmış ve oluşturulan bu yeni plazmidin (pETM6-PACF-pUC8:15) patojenik olmayan E. coli (C2987) suşuna transferi gerçekleştirilmiştir.Oluşturulan E. coli kfo+-vgb+ rekombinant suşundan elde edilen kondroitinin HPLC ve NMR analizleri ile moleküler yapı tayini gerçekleştirilmiştir. Daha sonra ise seçici sülfasyon yöntemi ile sülfatlama işlemi uygulanarak kondroitin sülfat üretilmiştir. Bu ürünün moleküler yapısı yine HPLC ve NMR analizleri ile kanıtlanmıştır. Analiz sonuçlarına göre; elde edilen kondroitin ve kondroitin sülfat sırasıyla 203.0 ve 269 Da molekül ağırlığına (MA) sahiptir.Kondroitin ve kondroitin sülfat içeren preparatların düşük MA değerinde, oral alım sonrası daha yüksek düzeyde absorbe edilerek tıp uygulamalarında daha etkin olduğu bilinmektedir. Sonuçlarımız; ülkemizde bu konuda mevcut araştırma eksikliğine katkı sağlayacak niteliktedir. Özgün ve yeni bir suştan elde edilen KS, güvenilir, yüksek saflıkta KS üretimi için yaygınlaştırılabilir ve tercih edilebilir bir değere sahiptir.Ürettiğimiz mikrobiyal KS, nütrosötik ve farmasötik özellik ve etkisinin araştırılmasına yönelik yapılacak daha sonraki deneysel çalışmalar için önemli bir kaynak olma potansiyeli taşımaktadır.

In this thesis; it is aimed to produce chondroitin sulfate (CS) which is a product derived from glycosaminoglycan has various applications in medicine, veterinary, pharmaceutical and cosmetics fields due to its unique features, from a new and recombinant microbial source by using reliable biotechnological methods instead of known animal sources. Within the scope of the work; first, the plasmid pUC8:15, carrying the gene vgb, was isolated from E. aerogenes [pUC8:15] strain and replicated. Then, by appropriate procedures, the vgb gene region was transferred to pETM6-PACF plasmid and this new plasmid (pETM6-PACF- pUC8:15) was transferred to the non-pathogenic E. coli (C2987) strain.Molecular structure determination of chondroitin obtained from the recombinant strain of E. coli kfo+-vgb+ was performed by HPLC and NMR analysis. Then, chondroitin sulfate was produced by sulfation process via selective sulfation method. The molecular structure of this product was also confirmed by HPLC and NMR analysis. According to the analysis results the chondroitin and chondroitin sulfate obtained have a molecular weight of 203.0 and 269 Da, respectively.It is known that preparations containing chondroitin and chondroitin sulphate with low MA are absorbed at higher levels after oral intake and are more effective in medical applications. Our results will contribute to overcome the lack of research on this subject in our country. KS obtained from a unique and new strain has a generalizable and preferable value for reliable, high purity KS production.The microbial KS we produce has the potential to be an important source for further experimental studies to investigate the nutritional and pharmaceutical properties and effects.