Kalıtsal kan hastalıklarında (talasemi, HbS ve G6PD eksikliği) eritrosit membranın incelenmesi

Abstract

Çukurova bölgesinde kalıtsal kan hastalıklarından p-talasemi, HbS geninin cıklıgı ve G6PD enzim eksikliği provalan- Ei yapılan araştırmalara göre oldukça yüksek bulunmuştur* Talaş emi ve G6PD enzim eksikliğinde eritrositlerin ozmotik frajilitoleri düşüktür. Bu nedenle hemolize karşı dirençlerinde azalma göze çarpmaktadır. HbS içeren eritroistlerdc ise tam tersine ozmotik frajiliteleri yüksek olup hemolize karşı dirençleri artmıştır* Eritrosit membranınm en önemli fonksiyonlarından biri ozmotik basınca karşı koyarak hemolizi önlemektir. Bu nedenle bu araştırmada yukarda adı geçen hasta gruplarında hemoliz mekanizmasını açıklayabilmek için membran proteinlerinin incelenmesi amaçlanmıştır* / Bu amaçla 20 kontrol, 4 HbSB'li, 2 HbAB-GfirD'cı eksik, 6 G6PD enzim eksikliği, 4 homozigot 6-Tal ve 8 heterozigot 0~Tal olmak üzere toplam 46 örnekle çalışılmıştır* Hasta grupları Ç* ö* Tıp fakültesi Biyokimya anabilin»dalında yapılan taramalar sonucuna göre seçilmiştir. Her kan örneği ayrı ayrı hepariniae ve ACD'li tüplere alınmıştır. örneklerin hematolojik parametreleri heparinize tüplere alınan kanlardan Coulter-Counter 'de yapılmıştır» Daha sonra eritrosit mcmbranı hazırlamak amacıyla ACO' li tüplerdeki kan Örnekleri kullanılmıştır. Ancak daha önce deneylerimizde stabilite sağlamak amacıyla optimal koşullar teepit edilmiştir. Bu amaçla SDS-PAGE tekrarlanabilirligi, optimal pH, optimal SDS konsantrasyonu ve eritroistlerin saklanma süresi gibi kavramlar ünerinde ön denemeler yapılmıştır. Optimal koşullar ve deneyin tekrarlanabilirligi tespit edildikten sonra örneklerin eritrosit membr ani arını hazırlama safhasına geçilmiştir. Her kan örneği izotonik fosfat tamponunda (pH 7. 4) 3 defa yıkanarak supernatant atılmıştır. Elde edilen eritrosit peleti hipotonik fosfat tamponu (pH 7* 4) ile supernatant soluk pembe veya renks i Eİeş inceye kadar yıkanmıştır. Daha sonra elde edilen membrandaki proteinleri lipid tabakasından kurtarmak için solubilisasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Bu işlem sonucunda serbest hale geçen proteinlerin SDS-PAGE 'ler i yapılarak j ellerin grafikleri çizilmiştir. Grafiklerden her protein fraksiyonuna ait pikin total protein miktarına göre X değerleri hesaplanmıştır. /Elde edilen bulgulara göre hasta grupları kontrol grubu ile karşılaştırıldığında HbSS'li eritrositlerin protein fraksiyonlarında önemli bir değişiklik gözlenmemiştir. Bu eritrositlerdeki membran sertliği membran proteinleri ağısından tartı ş ı lamamaktadı r. HbA6-C6PD'sı ekEik hasta grubu ise kontrol grubu ile karşılaştırılırsa spektrin fraksiyonunda «50 'ye varan bir artış, bant 4* 1 proteini ve bant 3 proteininde azalma gözlenmiştir. Elde edilen sonuçlardan da agıkça görüldüğü gibi bu haata grubundaki anormallikler G6PD enzim defektine bağlıdır. Spektrin eksrabi lit es indeki artış membran iskeletinin zayıflaması olasılığını düşündürmektedir. Bant 4.1 proteinindeki düşüklük bu düşüncenin doğruluğunu kuvvetlendirmektedir. Ayrıoa bant 3 proteinindeki azalma da iskeletin membran lipid tabakasına bağlanmasındaki sayıfıgınm göstergesi olarak kabul edilebilir. Yukarda sayılan nedenlerden dolayı HbAS-G6PD'sı eksik hastalarda ve G6PD eksik hasta grubunda gözlenen hemoliz ve anemik tablonun membran proteinleri açısından izah edilebilir olduğu düşünülmektedir. j3-talasemik hasta grubunda özellikle homozigot J3-Tal eritroE itlerde eşleşmemiş alfa globinin, membrana pres ipi tas yonu ile başta membran iskeleti olmak üzere bütün membran proteinlerinin karşılıklı bağlanmalarını etkileyerek zayıflattığını düşündürmüştür. Spektrin bantının bu hastagrubunda yüksek bulunması kuvvetlendirici bir kanıt olarak kabul edilebilir* Heterozigot p-Tal eritrositlerinde yukarda sayılan anor malliklerin gözlenmemesi sebebiyle anemik tablonun ve hemolisin daha hafif seyretmesine bağlanabilir* Sonuç olarak anemik vakalarda hemolizin mekanizmasını tam anlamı ile ortaya koyabilmek için eritrosit mcmbranı üzerindeki çalışmaların özellikle moleküler düzeyde daha yoğun bir şekilde devam ettirilmelidir. Daha ileri bir araştırma ise genetik çalışmalarla membran yapısında yer alan proteinlerin gen düzeyinde olası mutasyonları tespit ederek önemli aşamalar kayd edileceği kanısındayız* /