Çukurova` da saptanan G6PD varyantlarının mutasyon noktalarının moleküler düzeyde saptanması

Abstract

ÖZET Yaşam için gerekli ürünlerin redüklenmesinde önemli işlev gören NADPH, temel olarak PFY'un ilk ve hız sınırlayıcı enzimi olan G6PD tarafından sentezlenir. Geçmişte ve bugünde sıtmanın endemik sıklıkta bulunduğu yörelerde polimorfik sıklıkta olan G6PD eksikliğinin, dünyada yaklaşık 400 milyon insanı etkilediği ileri sürülmektedir. Bununla birlikte, bu sıklığa koşut olarak değişik kinetik özelliklere sahip yaklaşık 400 'ün üzerinde G6PD varyantı vardır. Bu heterojenite, bilimsel gelişmeler ile bozulmuştur. Biyokimyasal temelde birbirinin aynı olan varyantların moleküler düzeyde birbirinden farklı, ayrı olanların da birbirinin eşi olduğu saptanmıştır. Akdeniz bölgesinde en yüksek sıklıkta bulunan Gd Mediterranean varyantının, bir istisna dışında tek varyant olduğu bulunmakla beraber, farklı kinetik özelliklere sahip varyantların Gd Mediterranean ile aynı mutasyonu içerdikleri gösterilmiştir. Akdeniz havzasında yer alan Çukurova'da, enzim eksikliğinin halk sağlığı sorunu oluşturacak kadar sık olduğu, enzimin biyokimyasal temelde heterojen bir yapı gösterdiği bilinmektedir. Bu bulgular ışığında bölgemizdeki heterojenite varlığının moleküler düzeyde olup olmadığı, bunun yanında Gd Mediterranean (563. nt C-»T değişimi) ile 1311 polimorfik yöre mutasyonunun (C-*T değişimi) gen sıklığı ve her iki mutasyonunun birbiriyle ilintisi incelenmek istenmiştir. Belirlenen amaç doğrultusunda Hatay, İçel, ve Adana' da yapılan tarama çalışmalarında G6PD aktivitesi eksik ve normal örneklere ilaveten daha önce fenotipik özellikleri tanımlanmış varyantlar (E.Ö. isimli birey, Gd Balcalı, Gd Adana ve erkek kardeşi) çalışma kapsamına alınmıştır. Sağlıklı grubun oluşturduğu 20 örneklik kontrol grubu dahil toplam 122 kişi incelenmiştir. Hematolojik ve G6PD aktivite değerleri çalışılan örneklerin lökosit DNA' ları elde edilmiştir. Moleküler çalışmanın yapılabilmesi için, 563 ve 1311 100mut asyonl arının bulunduğu 6. ve 11. eksonu amplifiye edecek primerler sentezlenmiştir. G6PD geninin en verimli amplifikasyon koşulları saptanmıştır. Altıncı eksonu amplifiye örnekler 563 mutasyonu için AZfooII restriksiyon enzimiyle, 11. eksonu amplifiye örnekler ise 1311 mutasyonu için Bell retriksiyon enzimiyle kesilmiştir. G6PD aktivitesi, araştırma kapsamındaki tüm örneklerde 5, 2 ±4, 5 Ü/gHb, çalışma grubunda 4, 2 ±4, 2 Ü/gHb, kontrol grubunda ise 10,Ö±1,7 Ü/gHb olarak bulunmuştur. Değerler cinsiyete göre incelendiğinde, çalışma grubundaki erkeklerin 2,4+3,7 Ü/gHb enzim aktivite değeri, 5,7±4,0 Ü/gHb değerine sahip kadınlardan anlamlı olarak düşük olduğu gözlenmiştir. Gelişme ve yetişkin olarak iki yaş grubuna ayrılan tüm örnekler, G6PD aktivitesi açısından değerlendiğinde gelişme döneminde daha küçük değer elde edilmiştir (sırasıyla, 3,6±3,7 ve 5,7±4,6 Ü/gHb). Araştırmaya alman tüm örneklerde Gd Mediterranean (563. nt C-s>T) mutasyonu incelenmiştir. Biyokimyasal temelde Gd Adana ve Gd Balcalı olarak tanımlanmış örneklerden Gd Adana' da 563 ve 1311 nokta mutasyonunun varlığı gösterilirken Gd Balcalı' da bu mutasyonlar saptanamamıştır. Kinetik ve klinik özellikleri Gd B ve Gd Mediterranean' dan farklı E.Ö. isimli bireyde de 563 ve 1311 mutasyonu bulunmuştur. 563 ve 1311 mutasyonu açısından incelemeye alınmış tüm örneklerde 563 T gen sıklığı %31,7 iken 1311 T gen sıklığı %45,0 olarak saptanmıştır. Çalışma grubunda 563 T ve 1311 T mutasyonun gen sıklığı, sırasıyla %37,1 ile %49,7'dir. Hematolojik ve G6PD değerleri normal olan kontrol grubundaki bir kadında heterozigot olarak 563 C-*T değişimi tanımlanırken 6 örnekte de 1311 mutasyonu gösterilmiştir. Enzim aktivitesi sıfır olan erkeklerin %100'ü, kadınların ise %71,4'ü Gd Mediterranean mutasyonu taşımaktadır. Bunlara ilaveten, enzim aktivitesi normal erkeklerde mutant 563 T geni saptanamazken kadınlarda %15 gen sıklığında bulunmuştur. HbS geni taşıyan örnekler ile G6PD eksikliği arasındaki ilişki, hem enzim aktivitesi hem de moleküler düzeyde HbAA ile olandan daha az olarak bulunmuştur. Çalışma grubunda irdelenen 23 kişilik birbiriyle akraba HbE'li örneklerden 6'sında 563 101nokta mutasyonu, 11' inde de 1311 mutasyonu gösterilmiştir. HbS de içeren topluluktaki bu bulgular, tarihsel göç yollarının anlaşılmasına katkı sağlamıştır. Saptanan 563 ve 1311 mutasyonlarınm, biri kadın biri erkek dışında, tüm örneklerde birlikte gözlenmesi, iki mutasyon arasında bir `linkage equlibrium`un varlığını ortaya koymuştur. Sonuç olarak, Gd Mediterranean mutasyonunun %31,7'lik gen sıklığı, G6PD enzim eksikliğinin yöremizde halk sağlığı sorunu olmaya devam edeceğinin göstergesidir. Ayrıca, enzimin metabolizmadaki özel konumundan dolayı G6PD üzerindeki bilimsel çalışmalar, önemini korumayı sürdürecektir. 102

7. ABSTRACT NADPH, which has an important function in reduction of products necessary for life, is particularly synthesized by G6PD, the first and rate limiting enzyme of pentose phosphate pathway. It has been documented that about 400 million people are affected by G6PD deficiency all over the world, especially in the regions where malaria is endemic. As being parallel to this frequency, there are about more than 400 variants which have different kinetic properties. However, this heterogeneity is changed by scientific advances. It has been shown that variants that were established by having different biochemical properties had the same molecular mutation. On the other hand, biochemically unique variants such as Gd A` were shown to have different molecular mutations. Although, Gd Mediterranean which is the most common variant found in the Mediterranean basin showed the mutation at 563 with only one exception, variants obtained with different kinetic properties also showed the Mediterranean mutation. It is well known that in Çukurova which is in the Mediterranean region, there is a high frequency of G6PD deficiency and is a major public health problem there. Also, the heterogeneity of the enzyme was well documented. Thus, in this study we wanted to examine the presence of the Mediterranean mutation in the region and find the gene frequency of Gd Mediterranean (563 nt C-»T transition) as well as 1311 polymorphic site mutation (C-»T). Also, we wanted to find if variants previously established by biochemical properties had the Mediterranean mutation. For this purpose, we obtained blood samples from normal individuals, control group, and from screening studies of Hatay, İçel and Adana previously established to have abnormal G6PD levels. The variant group comprised the samples that were previously studied like Gd Balcalı, Gd Adana, and his brother, 103and patient named EÖ. Thus, a total of 122 samples (20 controls) were taken into study. DNA was prepared from leucocyte by the method of Poncz. For the molecular studies, primers were synthesized for the amplification of the exon 6 and 11 where 563 and 1311 mutations were localized. The optimum conditions for the amplification of the G6PD gene were determined. In cases where exon 6 were amplified, the samples were digested with restriction enzyme MboII and fragments were analyzed. For 1311 site mutation, restriction enzyme Bell was used. G6PD activity was found to be 5.2±4.5 IU/gHb in the total samples, 4.2±4.2 IU/gHb in the study group and 10.0±1.7 IU/gHb in the control group. When the samples were examined according to sex, the enzyme activity values of the male group (2.4±3.7 IU/gHb) were found to be statistically significantly lower than those of women (5.7±4.0 IU/gHb). The samples were also divided into two groups as adults and children and lower G6PD activity values were obtained in the children group (3.6+3.7 and 5.7±4.6 IU/gHb, respectively). When the Gd Mediterranean (563 nt C-»T) mutation was investigated in the variants Gd Adana had the mutation at 563 as well as 1311 polymorphism whereas Gd Balcalx had neither of them. In subject named EÖ whose clinical findings were normal but was a variant different from Gd B and Gd Mediterranean, 563 and 1311 mutation were found. 563 T gene prevalence was determined as 31.7% and 1311 T gene prevalence as 45% in the total samples investigated for 563 and 1311 mutations. Gene prevalence in the study group of 563 T and 1311 T mutations were 37.1% and 49.7%, respectively. In the control group, one female who had normal hematological and G6PD values, showed heterozygosity for 563 mutation while 6 persons showed the 1311 mutation. 100% of the men and 71.4% of the women with nil enzyme activity had Gd Mediterranean mutation. Although, no mutant 563 T gene was determined in men with normal enzyme activity, in women the gene prevalence was found to be 15%. The correlation between HbS gene and G6PD deficiency was 104found to be lower than for HbAA subjects for both enzyme activity and mutation wise. It was interesting to find 563 and 1311 mutation in HbE subjects. The data obtained for 563 and 1311 mutations seemed to show that there was a linkage equilibrium between the two mutations. As a result, the high frequency (31,7%) of Gd Mediterranean mutation shows that G6PD deficiency is an important public health problem in Çukurova and that further research should be continued on this unique enzyme. 105