Kayseri yöresinden toplanmış culex pıpıens (dıptera: culıcıdae) türlerinin beslenme eğilimlerinin moleküler yöntemlerle saptanması

Abstract

Bu çalışma, `Dirofilaria immitis'in Vektör Sivrisineklerde Moleküler Biyolojik Tanısı ve Kayseri Yöresinde Vektör Sivrisineklerin Ekolojisi` isimli ve 107O533 kodlu TÜBİTAK araştırma projesi kapsamında Kayseri yöresinden toplanmış ve uygun şartlarda muhafaza edilmiş olan sivrisinekler üzerinde yürütülmüş olup çalışmada Cx. pipiens tür kompleksinin moleküler karakterizasyonu ve ergin dişilerin kan beslenmesinde konak tercihleri ile konak spekturumlarının ortaya konması amacıyla planlanmıştır. Bu amaçla toplam 1284 ergin dişi sivrisinek morfolojik olarak incelenmiş ve 376'sı (%28,4) Cx. pipiens olarak teşhis edilmiştir. Ergin dişi Cx. pipiens örneklerinden genomik DNA ekstraksiyonu yapılmış ve mitokondrial cytochrome oxidase I (mt-COI) gen bölgesi parsiyel olarak amplifiye eden primerler ile PCR analizine tabii tutulmuştur. Amplifikasyon sonucu uygun bant profilleri gösteren örneklerden seçilen 2 izolat jel pürifiye edildikten sonra moleküler karakterizasyon ve filogenetik analizler amacıyla sekanslanmıştır. Parsiyel mt-COI nükleotid sekansları ortaya konan TrERUCxpip01 (GenBank aksesyon: KJ858517) ve TrERUCxpip02 (GenBank aksesyon: KJ858518) izolatlarının pairwise analizleri sonucu %100,0 identik oldukları belirlenmiş, Dünyanın farklı bölgelerinden GenBank'a kayıtlı diğer Cx. pipiens izolatlarıyla ise ortalama %0,3±0,1 genetik farklılık gösterdiği tespit edilmiştir. Ergin dişi Cx. pipiens örneklerinden bireysel olarak elde edilen genomik DNA'lar kanatlı ve memeli mitokondrial cyt b gen bölgesini spesifik olarak amplifiye eden primerler ile PCR analizleri gerçekleştirilmiş ve toplam 376 örneğin 148'i (%39,4) kanatlı ve/veya memeli kanı yönünden pozitif bulunmuştur. Pozitif belirlenen örneklerin toplam 43'ü yalnızca memeli, 98'i yalnızca kanatlı, 7'si ise hem kanatlı hem de memeli kanı yönünden pozitif belirlenmiştir. Beslenme eğilimlerinin istatistiksel analizinde Cx. pipiens için kanatlı tercihi önemli bulunmuştur (p<0,05). Konak kanı yönünden pozitif belirlenen örneklerden kanatlı için 15, memeli için de 15 izolat klonlandıktan sonra konak türü tayini için elde edilen plasmidler sekans analizine tabii tutulmuştur. Plasmidlerden elde edilen mt-cyt b sekanslarının GenBank'ta blastn analizleri sonucu konak türü identifikasyonları yapılmıştır. Kanatlı konak kanı pozitif 15 izolattan 9'unun Passeriformes takımında, 3'ünün Accipitriformes, 2'sinin Columbiformes ve birinin de Strigiformes takımında yer alan kanatlı türlerinden kan emdiği belirlenmiştir. Memeli konak kanı pozitif 15 izolattan ise 6'sı insan, 4'ü sığır, 3'ü koyun, 2'si de köpek kanı pozitif saptanmıştır.Sonuç olarak bu çalışma ile Türkiye'de ilk kez Cx. pipiens tür kompleksi üzerine morofolojik ve moleküler analizler bir arada kullanılarak karakterizasyon, filogeni ve kan beslenmesinde konak tercihi ve spekturumunun belirlenmesine yönelik bilimsel veriler elde edilmiştir. Anahtar kelimeler: Cx. pipiens, vektör, ekoloji, moleküler teşhis, Kayseri

This study was conducted on the mosquito specimens which were collected within the scope of the TUBITAK research project titled `Molecular Biological Diagnosis of Dirofilaria immitis in Vector Mosquitoes and The Ecology of Vector Mosquitoes in Kayseri Province` with project code 107O533 and preserved suitable conditions. The study was performed to determine the molecular characterization and, blood-meal analyses and host spectrum of the Cx. pipiens species complex collected from Kayseri region. For this aim totally 1284 female adult mosquito specimen were morphologically analyzed and 376 (28.4%) were identified as Cx. pipiens. Genomic DNAs were extracted from the individual Cx. pipiens specimens and mithocondrial cytochrome oxidase I (mt-COI) gen regions were partially amplified with the related primers in PCR. After the amplifications 2 isolates with suitable band profiles were gel purified and sequenced in order to molecular characterization and phylogenetic analyses. The isolates TrERUCxpip01 (GenBank accession: KJ858517) and TrERUCxpip02 (GenBank accession: KJ858518) which the nucleotide sequences were determined showed 100.0% identity to each other and 0.3±0.1 genetic difference was found with the other Cx. pipiens isolates from several regions in the world available in the GenBank. The genomic DNAs obtained from individual Cx. pipiens specimens were also PCR analyzed with the primer pairs that amplified avian and mammalian mithocondrial cyt b gen region. 148 (39.4%) out of 376 specimens were found to be positive for avian and/or mammalian blood-meal. 43, 98 and 7 of the positive specimens were found as only mammalian, only avian and both avian and mammalian blood-meal. The statistical analyses of host tendency in blood-meal revealed that avian preference was more important for the Cx. pipiens (p<0.05). Each 15 blood-meal positive specimens for avian and mammalian hosts were selected and cloned, and the obtained plasmids were sequenced in order to determine the host species. The mt-cytb sequences obtained from the plasmids were analyzedby blastn in the GenBank and host species were determined. 9, 3, 2 and 1 out of the 15 avian blood-meal positive isolates were found to blood feed from the avian species in the Passeriformes, Accipitriformes, Columbiformes and Strigiformes orders, respectively. 6, 4, 3 and 2 out of mammalian blood-meal positive isolates were determined to blood feed from humans, cattle, sheep and dogs, respectively. In conclusion, scientific data about the characterization, phylogeny, host preference and spectrum in blood-meal of the Cx. pipiens species complex were revealed for the first time in Turkey with this study. Key words: Cx. pipiens, vector, ecology, molecular diagnosis, Kayseri