İnsan P53 tümör süpresör proteini ile insan aprataksin, sacm1l ve metap1 proteinleri arasındaki protein-protein etkileşimlerinin ortaya çıkartılması

Abstract

Amaç: p53 transkripsiyon faktörü; hücre döngüsünün durması, DNA onarımı ve apoptoz gibi birçok biyolojik fonksiyonlarda görev almaktadır. p53 aktivitesi, post-translasyonel modifikasyonlar dahil birçok faktör tarafından düzenlenir. Daha önce yapılan ön çalışmada, heterolog maya sistemindeki insan p53 aktivitesini düzenleyen antioksidan genlerin bulunması için antioksidan genleri bulunmayan 109 farklı mutant taranmıştır. Bu tarama kapsamında üç tanesinin (Δhnt3, Δsac1 ve Δmap1), yabanıl tip hücrelere kıyasla daha düşük p53 aktivitesi gösterildiği bulunmuştur. Bu genlerin insan homologlarının (APTX, SACM1L ve METAP1) p53 regülasyonunda rol oynamaları muhtemeldir. Tez çalışması dahilinde p53 ile insan APTX, SACM1L ve METAP1 proteinleri arasındaki protein-protein etkileşimlerinin tespit edilmesi amaçlanmıştır.Materyal ve Metot: p53 ve hedef proteinler arasındaki protein-protein etkileşimlerini incelemek için maya ve insan hücre kültür modelleri kullanılmıştır. Maya ikili hibrit sistemi ve Co-IP tekniklerinden faydalanılarak protein-protein etkileşimlerinin analizleri yapılmıştır.Bulgular: Maya ikili hibrit ile ilgili deneylerde protein interaksiyonlarının belirlenebilmesi için LacZ raportör geninden faydalanılarak analizler yapılmıştır. Analiz sonucunda p53 içeren transformantlar ile kontrol grubu transformantlar arasında p53-APTX transformantında anlamlı farklılık olduğu görülmüştür (p<0.05). Daha sonra yapılan Co-IP deneylerinde, normal büyüme şartlarındaki MCF 10A hücrelerindeki p53 ile hedef genler arasında Western Blot analizi ile direkt bir etkileşim saptanamamıştır.Sonuç: Analizler sonucunda sadece APTX' in p53 proteini ile etkileştiğini göstermektedir. Bununla birlikte, bu etkileşim MCF 10A hücrelerinde normal büyüme koşulları altında Co-IP deneyleri ile belirlenememiştir.Anahtar Kelimeler: APTX, kanser, METAP1, p53, protein-protein etkileşimi, SACM1L

Aim: : The p53 transcription factor is involved in many biological functions such as cell cycle arrest, DNA repair, and apoptosis. P53 activity is regulated by many factors, including post translational modifications. In a preliminary study, 109 different yeast mutants without antioxidant genes were screened to find antioxidant genes that regulate human p53 activity in the heterologous yeast system. Within the scope of this screening, three of them (Δhnt3, Δsac1 and Δmap1) were found to have lower p53 activity compared to wild type cells. Human homologs of these genes (APTX, SACM1L and METAP1) are likely to play a role in the p53 regulation. The aim of this thesis is to determine the protein-protein interactions between p53 and human Aprataxin, SACM1L and METAP1 proteins.Material and Method: Yeast and human cell culture models were used to study protein protein interactions between p53 and target proteins. Yeast two hybrid system and Co-IP techniques were used to analyze protein-protein interactions.Results: In assays on yeast two hybrid, analyzes were made using the LacZ reporter gene to determine protein interactions. As a result of the analysis, it was observed that there was a significant difference in p53-APTX transformant between p53 containing transformants and control group transformants (p <0.05). In the subsequent Co-IP experiments, under normal growth conditions, direct interaction between p53 in MCF 10A cells and target genes was not detected as a result of Western Blot analysis.Conclusion: Our results suggest that only APTX interacts with p53 protein. However, this interaction was not be able to confirmed by the Co-IP experiments under normal growth conditions in MCF 10A cells.Key words: APTX, cancer, METAP1, p53, protein-protein interaction, SACM1L.