Effects of beta-tricalcium phosphate concentration on osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells in chitosan based composite scaffolds

Abstract

Günümüzde hasarlı sert dokunun onarımı için doku nakli uygulamaları yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Otogreftler altın standartlara sahip olmasına rağmen doku alınan bölgede meydana gelen hasar ve sınırlı greft bulunabilirliği, allogreftlerde ise immün sistem yanıtı oluşma riski gibi sınırlayıcı faktörlerden dolayı doku mühendisliği teknikleriyle üretilen sentetik kemik greftlerine olan ilgi her geçen gün artmaktadır. β-triskalsiyum fosfat (β-TCP), hidroksiapatit (HA) ve kalsiyum sülfat dahil olmak üzere birçok biyoseramik materyal yaygın olarak kemik ikame maddeleri olarak kullanılmaktadır. Yüksek osteokompatibilite, hızlı bozunma hızı ve yüksek mekanik dayanıma sahip olması nedeniyle β-TCP son yıllarda en çok tercih edilen biyoseramik olmuştur. Mevcut implant malzemelerinin önemli bir dezavantajı, sinterlenmiş katı ve sert formda olmalarıdır buda cerrahın uygulama sırasında cerrahi alanda greft malzemesinin istenilen şekli vermesini güçleştirmektedir. Bu durum kemik kaybı, sağlıklı çevre dokularda travma ve cerrahi sürenin uzaması gibi olumsuzluklara neden olmaktadır. Bu problemin üstesinden gelmek için polimer-seramik tabanlı kompozit iskeleler üretilerek, hem polimerik özelliği ile ekstraselüler matriksin taklit edilmesiyle hücre tutunumunu artırması hem de seramik özelliği ile kemik yapının taklit edilmesi ve osteokondüktif ve osteoindüktif özellik göstermesi hedeflenmiştir.Bu çalışma kapsamında farklı β-TCP oranına sahip kitosan tabanlı doku iskeleri dondurarak kurutma yöntemiyle hazırlanmıştır. Üretilen iskelelerin karakterizasyonu için Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ile morfolojik özellikleri incelenmiş ve por çapları hesaplanmıştır Aynı zamanda mekanik özelliklerinin belirlenmesi için basma testi gerçekleştirilmiştir.Üretilen iskelelerin biyouyumluluğu yapılan in-vitro sitotoksisite ve genotoksisite testleri ile desteklenmiştir. Kök hücre faklılaşması üzerindeki etkisinin incelenmesi için Kemik iliği Kökenli Mezenkimal Kök Hücreleri kullanılmış ve üretilen iskeler üzerine ekilmiştir. Hücre çoğalmasını incelemek için DNA kantifikasyonu, morfolojisini incelemek için SEM analizi yapılmıştır. Osteojenik Farklılaşmanın incelenmesi için 7,14 ve 21. Günlerde ALP analizi ile birlikte osteojenik spesifik genlerin ekspresyonu incelenmiştir.

Today, tissue transplant applications are widely used for repair of damaged hard tissue. Despite the gold standard of autografts, interest in synthetic bone grafts produced by tissue engineering techniques is increasing day by day, due to limiting factors such as damage to the tissue site and limited graft availability in allografts, and the risk of developing an immune system response in allografts.Many bioceramic materials, including β-tricalcium phosphate (β-TCP), hydroxyapatite (HA) and calcium sulfate, are widely used in bone tissue engineering. β-TCP has been the most preferred bioceramics in recent years due to its high osteo-compatibility, fast degradation rate and high mechanical strength.A major disadvantage of existing implant materials is their sintered solid and hard form, which makes it difficult for the surgeon to adapt the surgical graft material to the desired shape during surgery. This causes bone loss and trauma to healthy peripheral tissues and prolonged surgical time. Polymer-ceramic based composite scaffolds are produced to overcome this problem. It is aimed to increase cell adhesion by mimicking the extra cellular matrix with its polymeric character and to imitate bone structure with ceramic character and show osteoconductive and osteoinductive properties.Within the scope of this study, chitosan based scaffolds with different β-TCP ratios were prepared by freeze drying method. For characterization of the scaffolds produced, morphological characteristics were investigated by Scanning Electron Microscope (SEM) and pore diameters were calculated. At the same time, compression test was performed to determine the mechanical properties. The biocompatibility of the produced scaffolds was supported by in vitro cytotoxicity and genotoxicity tests. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells were used and cultured on scaffolds for the investigation of the effect of β-TCP content on stem cell differentiation. DNA quantification was performed to examine cell proliferation, and SEM analysis was performed to examine cell morphology. In order to examine osteogenic differentiation, the expression of osteogenic specific genes together with ALP analysis on days 7, 14 and 21 was examined.