The effect of antibacterial photodynamic therapy on healthy fibroblast and keratinocyte cells

Abstract

Antibakteriyel fotodinamik terapi ışık, ışığa duyarlı ilaç (fotosensitizer) ve oksijenin varlığında gerçekleşen bir tedavidir. Fotosensitizan uygun dalga boyundaki ışık ile uyarıldığında ortamdaki moleküler oksijen ile reaksiyona girerek reaktif oksijen türlerinin ortaya çıkmasına neden olur. Reaktif oksijen türleri hücrelerde oldukça sitotoksik etkiler gösterir ve hücrelerin ölmesine neden olur. Son yıllarda bakterilerin antibiyotiklere karşı direnç geliştirmesi enfeksiyon tedavilerinin zorlaşmasına neden olmuştur. Bu durum insan ve hayvan sağlığını tehdit eden bir sorun haline gelmiştir. Bu sebeple antibakteriyel fotodinamik terapi, enfeksiyon tedavisinde patojenlerin fotoinaktivasyonunu sağlayan alternatif bir yaklaşım olmuştur. Bu yöntemde tek önemli konu patojenlerin yüksek oranda öldürülmesi değil, yara iyileşmesinde önemli rolü bulunan sağlıklı hücrelerin antibakteriyel fotodinamik terapiden nasıl etkilendiğinin de bilinmesidir. Bu bakımdan, bu çalışmada bazı patojenler üzerindeki öldürücü etkisi daha önce kanıtlanmış olan indosiyanin yeşil maddesinin ve 808-nm dalga boyunda ışıma yapan diyot lazerin sağlıklı deri fibroblast ve sağlıklı deri keratinosit hücreleri üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Kliniğe taşınmak istenen fotodinamik terapi yönteminde sağlıklı hücrelere zarar vermeyecek ama patojenler üzerinde sitotoksik etkiler gösterecek ışık dozu ve ilaç konsantrasyonlarının belirlenmesi bu çalışmanın temel amacıdır.Bu çalışmada fotodinamik terapinin etkisi sağlıklı fibroblast ve keratinosit hücreleri üzerinde in vitro ortamda incelenmiştir. Patojenleri öldürebildiği kanıtlanan ilaç ve ışık dozları kullanılarak gerçekleştirilen uygulamalardan sonra hücrelere olan etkiler MTT Analizi, Lipid Peroksidasyon Analizi ve Akridin Turuncusu/Propidyum İyodür Boyaması yapılarak incelenmiştir. Sağlıklı deri fibroblast hücreleri ve sağlıklı deri keratinosit hücreleri sadece lazer uygulamasından olumsuz yönde etkilenmezken, indosiyanin yeşil yüksek konsantrasyonlarda uygulandığında hücrelere zarar vermiştir. 84 J/cm2 enerji dozu ile 4-125 µg/ml aralığındaki konsantrasyonlarda indosiyanin yeşil kullanılarak yapılan fotodinamik terapi uygulamaları keratinosit hücrelerine zarar vermemiştir. 252 J/cm2 enerji dozu uygulanması keratinosit hücrelerine tüm indosiyanin yeşil konsantrasyonlarında zarar vermiştir. Fibroblast hücreleri üzerindeki fotodinamik terapi uygulamalarında ise 4 µg/ml ve 10 µg/ml indosiyanin yeşil konsantrasyonu ile iki farklı enerji dozu hücrelere zarar vermemiştir.Bu uygulamalar sonucunda, fotodinamik terapi uygulamalarının ışık ve ilaç dozlarının optimizasyonu sağlanarak gerçekleştirilmesi gerektiği anlaşılmıştır. Fotodinamik terapi sırasında sadece patojenlerin öldürülmesi hedeflendiğinde sağlıklı hücreler zarar görebilmektedir. Kliniğe taşınmak istenen bu yöntemde doz optimizasyonu sağlandığında patojenlerin başarılı şekilde fotoinaktivasyonu sağlanırken çevre dokuda bulunan sağlıklı hücrelerin zarar görmesi engellenebilecektir.

Antibacterial photodynamic therapy is a treatment that occurs in the presence of light, photosensitizer and oxygen. The photosensitizer reacts with the molecular oxygen in the environment when it is stimulated by light at the appropriate wavelength, causing reactive oxygen species at the end. Reactive oxygen species show high cytotoxic effects on cells and cause necrosis or apoptosis. In recent years, the resistance of bacteria to antibiotics has caused infection treatments to become more difficult. This situation has become a threat to human and animal health. Therefore, antibacterial photodynamic therapy has been an alternative approach for the photoinactivation of pathogens in the treatment of infection. The only important issue in this method is not how high rate of pathogens are killed, but how healthy cells that play an important role in wound healing are affected by antibacterial photodynamic therapy. From this perspective, in this study the effects of indocyanine green and 808-nm wavelength diode laser whose lethal effect on some pathogens has previously been proven, on healthy skin fibroblast and healthy skin keratinocyte cells have been investigated. Photodynamic therapy which is intended to be used in clinics, the main objective of this study is to determine the dose of light and drug concentrations that will not harm healthy cells but will have cytotoxic effects on pathogens.In this study, the effect of photodynamic therapy on healthy fibroblast and keratinocyte cells was investigated in vitro. The effects on the cells after the applications, using the drug and light doses which was proved to be able to kill pathogens, were examined by MTT Analysis, Lipid Peroxidation Analysis and Acridine Orange/Propidium Iodide Staining. While healthy skin fibroblast cells and healthy skin keratinocyte cells were not only adversely affected by laser application, indocyanine green damaged the cells when applied at high concentrations. Photodynamic therapy applications using indocyanine green at 4-125 µg/ml concentrations and 84 J/cm2 energy dose did not damage keratinocyte cells significantly. Application of 252 J/cm2 energy dose damaged keratinocyte cells with all indocyanine green concentrations. In photodynamic therapy applications on fibroblast cells, two different energy doses and 4 µg/ml and 10 µg/ml indocyanine green concentrations did not damage the cells significantly.As a result of these applications, it has been understood that antibacterial photodynamic therapy applications should be applied by optimizing the light and drug doses. Healthy cells can be highly damaged if only photoinactivation of the pathogens is aimed during photodynamic therapy. When the dose optimization is achieved properly in this method, successful photoinactivation of the pathogens will be ensured and the damage of healthy cells in the surrounding tissue can be prevented or minimized.