Kuvars kristal mikroterazi sensör kullanılarak yapay tükürükte Escherichia coli ATCC 25922 bakterisinin sentetik DNA ile genetik tespiti

Abstract

Escherichia coli (E. coli) bakterisi, enfeksiyonlardan kaynaklanan dünya çapındaki salgın ve ölümlerin büyük bir kısmından sorumlu olan ve bilim dünyasında en çok çalışılan mikroorganizmaların başında gelmektedir. Bu tez çalışmasında, küresel bir halk sağlığı problemi olan antibiyotik direncine sahip E. coli bakterisinin, yapay tükürük numunesi içerisinde, Kuvars Kristal Mikrodenge (QCM) sensör ile hızlı ve yüksek hassasiyette genetik tespitini yapabilen bir sistem sunulmaktadır. Tasarlanan sistemde, tespit işleminin tükürük sıvısı içerisinde yapılması hasta, sağlık personeli ve maliyet açısından oldukça avantaj sağlayacaktır.Günümüzde E. coli bakterisinin genetik tespiti için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) altın standart olarak kabul edilmektedir. Fakat işlem süresinin uzun ve maliyetinin fazla olması gibi sebeplerden dolayı hali hazırda kullanılan yöntemlere karşı alternatif yöntemler aranmaktadır. Bu tez çalışmasında, sensör yüzeyine bağlanan analitlerin neden olduğu rezonans frekansındaki değişimlerin (∆f), nanogram seviyesinde bir hassasiyet ile ölçülmesini sağlayan Kuvars Kristal Mikrodenge (QCM) cihazı kullanılmıştır. Genetik tespite en uygun sensör yüzey modifikasyonunu elde etmek için (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane (MPS) ve 11-merkaptoundekanoik asit (MUA) kimyasal kaplama ajanları ile çalışılmıştır. EDC/NHS çapraz bağlayıcıları ile sensör yüzeyi amin reaktif olarak işlevselleştirilmiş ve prob DNA'nın (pDNA) sensör yüzeyine immobilizasyonunun ardından, Büyükbaş Serum Albümin (BSA) bloklama işlemi yapılmıştır. Son olarak da sensör yüzeyi, 4 farklı (0, 108, 1010, 1013 kopya/ml) sentetik hedef (veya target DNA (tDNA)) konsantrasyonuna maruz bırakıldı. Deneyler en az 3 kere tekrar edildi. Elde edilen sonuçlar model tükürükte Escherichia coli bakterisinin genetik tespitinin 108 kopya/ml hassasiyet ile DNA izolasyonu, pürifikasyonu ve amplifikasyonuna gerek olmadan tespit edilebildiğini ortaya koymaktadır.Anahtar Kelimeler: Biyosensör; QCM; Escherichia coli; Genetik Tespit

Escherichia coli (E. coli) bacteria is one of the most studied microorganisms in the scientific world, responsible for most of the worldwide epidemics and deaths caused by infections. In this thesis, a system capable of rapid and high-precision genetic determination of the E. coli bacteria with antibiotic resistance, which is a global public health problem, in the artificial saliva sample, with a Quartz Crystal Microbalance (QCM) sensor. In the designed system, carrying out the detection process in saliva will provide a great advantage in terms of patient, healthcare personnel and financial means.Today, polymerase chain reaction (PCR) has been accepted as the gold standard for the genetic detection of E. coli bacteria. However, alternative methods are sought against the currently used methods for reasons such as long processing time and high cost. In this thesis study, Quartz Crystal Microbalance (QCM) device, which enables the measurement of resonance frequency (∆f) caused by analytes connected to the sensor surface, with a precision at the nanogram level, was used. Chemical coating agents were studied using (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane (MPS) and 11-mercaptoundecanoic acid (MUA) to obtain the most suitable sensor surface modification for genetic detection. The sensor surface was amine reactively functionalized with EDC / NHS crosslinkers, and after immobilization of the probe DNA (pDNA) to the sensor surface, Bovine Serum Albumin (BSA) blocking was performed. Finally, the sensor surface was exposed to 4 different target DNA (tDNA) concentrations (0, 108, 1010, 1013 copy/ml). Each experiment was repeated at least 3 times. The results show that the genetic detection of Escherichia coli bacteria in model saliva can be detected with a precision of 108 copies/ml without the need for DNA isolation, purification and amplification.Keywords: Biosensor; QCM; Escherichia coli; Genetic Detection