Lokal Streptomyces izolatlarının biyoaktif sekonder metabolitlerinin kimyasal olarak taranması

Abstract

Yeni hastalıkların gelişmesi ve patojenlerde mevcut antibiyotiklere karşıdirencin artmasından dolayı yeni mikrobiyal metabolitlere sürekli ihtiyaçduyulmaktadır. Mikrobiyal sekonder metabolitler, potansiyel olarak sahipoldukları özel yapıları ve biyolojik aktiviteleri ile doğal bileşiklerin zenginkaynaklarından birini teşkil ederler. Actinomycetales ordusuna dahil olanStreptomyces türleri, çoğu biyolojik olarak aktif olan sekonder metabolitleriüretme yeteneğine sahip olan mikoorganizma grubudurlar. Bu sekondermetabolitlerden başlıcaları; antibakteriyel, antifungal ve antitümor ajanlarıdır.Yeni biyoaktif metabolitlerin keşfi için temel strateji Streptomyces gibi iyibilinen ve yetenekli organizmalardan yeni bileşiklerin taranmasıdır.Bu amaçlar doğrultusunda daha önce 3 farklı endemik bitkinin kökçevresi (rizosfer) topraklarından izole edilmiş olan 12 lokal izolatın, 16S rRNAgenleri kullanılarak yapılan moleküler teşhis çalışmalarında bu izolatlarınStreptomyces cinsine dahil oldukları bulundu. Moleküler teşhisi yapılan 12izolatın Benett + Glukoz besiyerindeki antimikrobiyal aktivitelerinin araştırılmasısonucunda bu izolatlardan 9'unun antimikrobiyal aktivite gösterdiği tespit edildi.Moleküler teşhis çalışmaları sonucunda daha önce Streptomyces sp.CAH29 olarak adlandırılan izolatın üretmiş olduğu sekonder biyoaktifbileşiklerinin kimyasal tarama yöntemi ile belirlenmesi amaçlandı. İzolat öncelikleantimikrobiyal bileşik üretme kapasitesi açısından 5 farklı besiyerinde üretildi.Elde edilen filtratlar farklı polarite özelliklerine sahip 3 farklı çözücü sistemi ileekstrakte edildi. Elde edilen organik ekstraktların antifungal ve antibakteriyelaktiviteleri belirlendi. Bu şekilde elde edilen ekstraktların test organizmalarıüzerine farklı inhibisyon etkileri gözlendi. En güçlü ve geniş spektrumdaantimikrobiyal aktivite elde edilen Benett + Glukoz besiyerinde daha genişölçekte üretilen Streptomyces sp. CAH29'un sekonder metabolitleri, en iyiaktivitenin gözlendiği etilasetat çözücüsü ile ekstrakte edildi. Ekstraklarıniçerdiği bileşikler, ince tabaka kromatografisinde (TLC) farklı çözücü sistemleriile birbirinden ayrıldı. Bileşiklerin en iyi olarak diklorometan ? metanol (9:1)çözücü sisteminde birbirinden ayrıldığı tespit edildi. TLC ile birbirinden ayrılmışbileşiklere ait spotlar biyootografi yöntemi ile test organizmaları üzerinedenendi. Rf değeri yaklaşık 0,69 olan spot bölgesinin hem antifungal hem deGram (+) organizmalara karşı antibakteriyel etkisinin olduğu tespit edildi. Bu spotbölgesindeki biyoaktif bileşiğin saflaştırılması amacıyla nonpolar karakterdekihekzan ? etilasetat ile polar karakterdeki etilasetat ve metanol çözücü sistemlerininkullanılmasıyla gerçekleştirilen kolon kromatografisinden 4 temel fraksiyon eldeedildi. İkinci bir kolon kromatografisi ve sonrasında uygulanan yüksekperformanslı ince tabaka kromatografisi (HPTLC) sonucunda hedeflenen bileşiksaf halde 2 mg olarak elde edildi. Saf olarak elde edilen bileşik farklı özelliktekiTLC reaktifleri ile muamele edilerek olası fonksiyonel grupları belirlendi.Ayrıca HPTLC sonucu saf bileşiğin 270 nm'de maksimum absorbans verdiğigörüldü. Son olarak bileşiğin Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenesve Candida albicans üzerine antimikrobiyal aktivite gösterdiği tespit edildi.Bileşiğin yapı aydınlatma çalışmaları devam etmektedir.

New microbial metabolites are permanently needed due to the increasein resistant pathogens and evolution of novel disease. Microbial secondarymetabolites represent a large source of compounds endowed with ingeniousstructure and potent biological activities. Streptomyces strains which arebelonging to the order Actinomycetales are suprerior to other actinomycetestrains in their ability to produce large number and varieties of bioactivemetabolites. The main compounds of these secondary metabolites areantibacterial, antifungal and antitümor agents. To explore new bioactive drug,the main strategy is to search for new compounds from well known andtalented microorganism, such as StreptomycesFor this purpose, 12 local strains were isolated from rhizospheric soils ofthree endemic plants. 16S rRNA genes of isolates were amplified. According to16S rDNA sequence analyses, we conclude that these local strains belong tomember of Streptomyces genus. Nine isolates were found to have antimicrobialactivity.In this study, our aim is to describe the bioactive secondary metabolitesproduced by Streptomyces sp. CAH29 using chemical screening methodology. Theısolate was grown at five different culture medium to determine the bestantimicrobial metabolite production. Culture supernatants were extracted withorganic solvents which have different polarity. The in vitro antimicrobial activitiesof the extracts were applied to a panel of bacteria and C. albicans. Then,Streptomyces sp. CAH29 was grown in large scale in the Benett + Glucosemedium which was the best for antimicrobial metabolite production. It wasdetermined that antimicrobial metabolites of CAH29 isolate were best obtained byethylacetat. Also, The compounds produced by isolates were separated usingdichloromethane-methanol (9:1) solvent system.Compounds separated with TLC were applied to agar to test the inhibitioneffects of spots to microorganisms by using bioautography methods. The spot withRf value about 0.69 have both antibacterial and antifungal activity. To purify thiscompound, extracts loaded on columns and elution was carried out with differentcombinations of solvents such as hexane-ethylacetate, ethylacetate and methanol.Active fractions obtained from first column were combined and loaded to secondcolumn. Active fractions eluted from second column were applied to highperformance thin layer choromatography (HPTLC) plates to purify target compound.2 mg pure compound was obtained from the last step of prurification. Compoundwas treated with different chemical reagents to highligths its possible functionalgroups Pure compound was showed maximum absorbance at 270 nm. Finally, itwas determined that the compound have antimicrobial activity againistStaphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes and Candida albicans. Thestudies on structure elucidation of pure compound are on going.