Geobacillus stearothermophilus`tan ekstraselüler ?-amilaz enziminin izolasyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada DSMZ'den alınan Geobacillus stearothermophilus suşu kullanılarak bu bakteriden elde edilen ?-amilaz enziminin üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu gerçekleştirildi.Bakteri üremesinin optimum koşuları, 16.saat, 55 oC ve pH 7.0 olarak tespit edildi. Maksimum enzim üretim süresi 24.saat olarak belirlenerek bu koşullarda bakteri üretimi gerçekleştirildi. Üretilen bakteriden alınan üst sıvıda ?-amilaz enzim aktivitesine bakılarak enzimin optimum sıcaklığı 70 oC, pH'sı ise 7.0 olarak belirlendi. Enzim üretimi üzerine karbon ve azot kaynaklarının etkisi denendi. Karbon kaynaklarından sükroz ve laktozun enzim üretimini inhibe ettiği belirlendi. Azot kaynaklarının enzim üretimine etki etmedikleri gözlendi. Enzim üretimi üzerine çeşitli konsantrasyonlarda CaCl2'nin etkisi araştırıldı. CaCl2 varlığında enzim üretiminin arttığı tespit edildi. Maksimum enzim üretimi 10 mM'da elde edildi. ?-Amilaz enzimi jel filtrasyon ve iyon değiştirici kromatografisi ile saflaştırıldı. Saflaştırma kat sayısı 65, verim % 46 olarak belirlendi. Saflaştırılan enzimin molekül ağırlığı SDS-PAGE ile 63 kDa olarak tespit edildiSaf enzim üzerine EDTA, PMSF, DTT, ß-mercaptoethanol ve Etanol gibi inhibitörlerin etkisi denendi. Yapılan çalışma sonunda en yüksek inhibisyon etkisi 1 mM'lık EDTA (% 65) ve 10 mM'lık EDTA (% 89) ile elde edildi. Konsantrasyon artışına paralel olarak enzim aktivitesi üzerine olan inhibisyon etkisinin arttığı tespit edildi. Saf enzim aktivitesi üzerine bazı metallerin etkisini saptamak için 1,5 mM CaCl2, CuCl2, ZnCl2 MgCl2, HgCl2, MnCl2, CoCl2 ve FeCl2 test edildi. CaCl2 (%123) ve MnCl2`ün (%122) aktiviteyi artırdığı; CuCl2 (%81) ve HgCl2'ün (%83) ise enzim aktivitesini inhibe ettiği tespit edildi. Saflaştırılan enzimin 50oC ile 60oC'de ve pH 7.0'de stabil olduğu belirlendi. Km ve Vmax değerleri Lineweaver?Burk plot'a göre sırasıyla 0,051 mM ve 1,424 ?mol/dk. olarak hesaplandı.

In this study, production, purification and characterization of ?-amylase from the strain Geobacillus stearothermophilus obtained from DSMZ were examined.Optimal conditions of bacterial growth were determined at 16th hour, 55°C and pH 7.0, respectively. Maximum enzyme production time was determined as 24th hour and bacteria production was conducted in these conditions. ?-Amylase enzyme activity was tested in the supernatant from produced bacteria and optimum temperature of enzyme activity was determined as 70°C, and pH was 7.0. The effect of carbon and nitrogen sources on the production of enzyme was investigated. It was found that carbon sources, sucrose and lactose inhibited the enzyme production. It was observed that nitrogen sources did not influence the enzyme production. The effect of various concentration of CaCl2 on the enzyme production were examined. The enzyme production was increased in the presence of CaCl2. Maximum enzyme production was achieved at the presence of 10 mM CaCl2. ?-Amylase was purified by gel filtration and ion exchange chromatography. Purification coefficient was determined to be 65, and yield as 46%. Molecular weight of the purified enzyme was found to be 63 kDa by SDS-PAGE.The effect of some inhibitors such as EDTA, PMSF, DTT, ß-mercaptoethanol, Etanol and on purified enzyme was studied. At the end of this study, the highest inhibitory effect 1 mM EDTA (65%) and 10 mM EDTA (89%) was obtained. It was determined that the inhibitory effect on enzyme activity increased in parallel with the increase in the concentration. To determine the effect of some metals on pure enzyme activity of pure enzyme, 1,5 mM CaCl2, CuCl2, MgCl2 ZnCl2, HgCl2, MnCl2, CoCl2, and FeCl2 were tested. Enzyme activity was increased in presence of CaCl2 (123%) and MnCl2 (122%), while activity of the enzyme was inhibited in presence of CuCl2 (81%) and HgCl2 (83%). It was determined that the purified enzyme was stable at 50oC and 60oC, and pH 7.0. Km and Vmax were calculated as 0,051 mM and 1,424 ?mol/min respectively according to the Lineweaver-Burk plot.