Investigation of delayed type hypersensitivity response against crimean-congo hemorrhagic fever virus nucleoprotein

Abstract

Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsünün (KKKAV) yol açtığı Kırım KongoKanamalı Ateşi (KKKA) çok geniş bir coğrafyada etkin olan ve %5 ile %50 arasında değişenfatalite oranına sahip bir hastalıktır. KKKAV Bunyaviridae ailesinin bir üyesi olup,Nairovirus cinsi altında sınıflandırılmaktadır. KKKAV genomu üç tane negatif sarmallı RNAsegmentlerden oluşmaktadır. RNA'ya bağlı viral RNA polimerazı L segment tarafındanüretilmektedir. S segment nükleoproteinleri, M segment ise Gn ve Gc proteinlerinikodlamaktadır. Viral replikasyonun ve transkripsiyonun konakçı hücrede başlayabilmesi içintüm segmentlerin nücleoproteinler (NP) tarafından sarmalanması gerekmektedir. KKKAV Ssegmenti 53 kDa ağırlığındaki NP kodlamaktadır. KKKA genellikle hafif ve spesifik olmayanateşli bir hastalık olarak rapor edilmiştir ancak bazı vakalarda çok şiddetli hemorajik hastalıkgelişebilmektedir. Hastalığın 5 ile 14. günleri arasında devam eden hemoraji, çoklu organbozukluğu ve şok ile sonuçlanabilmektedir. Viral enfeksiyonlarla mücadele esnasında, hücrearacılı immünite önemli bir rol oynamaktadır. Bu yüzden KKKAV enfeksiyonlarının hücreselimmünite üzerindeki rolünü aydınlatmak oldukça önemlidir. Bu amaçla, çalışmamızda hayvanmodellerinde KKKAV'ye karşı oluşacak gecikmiş tip hipersensitivite (delayed typehypersensitivity- DTH) reaksiyonunun varlığının araştırılması hedeflenmiştir. Bu amaçla,KKKAV NP (1449 bç), NP'nin N-terminal parçası, NPNT (387 bç) ve NP'nin C-terminalparçası, NPCT (513 bç) rekombinant olarak prokaryotik ekspresyon sistemlerinde üretilerekDTH üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Fare immunizasyon çalışmalarının ardından üç farklıdozda (50 μg/μl, 100 μg/μl, 200 μg/μl) antijen fare ayak tabanlarına enjekte edilmiş ve ayaktabanındaki şişme elektronik kumpas aleti ile ölçülmüştür. Yirmi dördüncü saatte oluşan DTHcevabı her bir protein için en yüksek değeri göstermiş ve 72. saate doğru bu cevap azalmıştır.Antijen enjekte edilen sağ ayak tabanındaki şişlik, kontrol grubuna kıyasla istatistiksel olarakanlamlı bulunmuştur (p<0,05). DTH reaksiyonu oluşturmak için 100 μg/μl ideal doz olaraksaptanmıştır. Bu çalışmada KKKAV NP'nin CD4+ T hücre epitoplarına sahip olduğu ve Nterminalkısmın C- terminale göre daha güçlü bir antijenite geliştirdiği gözlemleniştir.Hücresel immüniteyi tetikleyen viral proteinlerin rolü henüz tam olarak bilinmediği için, buçalışmaların KKKAV hakkındaki bilgiye katkıda bulunacağı düşünülmektedir. Bu bilgilerayrıca aşı tasarımı ve antiviral terapi stratejilerinin geliştirilmesi amacıyla kullanılabilecektir.

Crimean–Congo hemorrhagic fever (CCHF) caused by CCHFV is reported in a widegeographic range with a fatality rate ranging from 5 to 50 %. CCHFV is a member of thefamily Bunyaviridae and classified in Nairovirus genus. CCHFV genome is composed oftripartite single-stranded negative RNA segments, and RNA dependent viral RNApolymerase is produced by L segment. S segment encodes nucleoprotein (NP) and M segmentexpresses Gn and Gc. To initiate the viral replication and transcription in the host cell, thesegments are needed to be encapsidated by NP. The S segment of CCHFV encodes 53 kDaNP made up of globular domain with a prominent arm. CCHFV infection is generallyreported as a mild, nonspecific febrile illness but in some cases, severe hemorrhagic disease isalso developed. Persisting hemorrhage, multi-organ failure and shock result in fatality on day5-14 of illness. In combatting against viral infections, CMI plays a pivotal role. Therefore it isessential to clarify the role of cellular immunity in CCHFV infection. In this study, we aimedto investigate the presence of delayet type hypersensitivity (DTH) reactions against CCHFVin an animal model. For this purpose, CCHFV NP (1449 bp), N-terminal part of NP, NPNT(387 bp) and C-terminal part of NP, NPCT (513 bp) were recombinantly produced inprocaryotic expression systems and investigated their effect on DTH. Followingimmunization steps, antigens were injected in three different dosage (50 μg/μl, 100 μg/μl,200 μg/μl) and footpad swelling was measured by an electronic caliper. For each protein,DTH response has peaked at 24 hr and decreased by 72 hr. Footpad swelling was statisticallysignificant on right hind pad injected with antigen for each groups, compared to negativecontrol (p<0,05). 100 μg/μl was found to be optimum dose for DTH response. The results ofthis study demonstrate that, CCHFV NP contains CD4+ T cell epitopes and N-terminal part ofCCHFV NP developed stronger antigenicity than C-terminal part. Because, the exact roleplayed by each protein in developing a cellular immunity against the whole virus have notbeen studied in detail, any information on the individual proteins and on the cellular immuneresponse will be a wellcomed addition to the data on CCHFV. These information would beused in developing strategies in designing vaccines as well as on antiviral approaches.