An integrative gene-expression analysis of axolotl limb wound healing and regeneration

Abstract

Aksolotl, üstün rejeneratif ve hasarsız yara iyileşme kabiliyeti sergileyen, kaybedilen ve zarar görmüş olan bir uzvu tamamen ve etkin bir şekilde iyileştiren ürodele amfibilerinin bir üyesidir. Aksolotl yakın zamanda rejeneratif biyoloji ve tıp alanlarında güçlü bir deneysel model olarak kullanılmaya başlanmıştır. Bazı çalışmalarda, aksolot uzuvunun rejeneratif ipuçlarını topluca açığa çıkarmak için yüksek verimli, omik tabanlı yaklaşımlar kullanılmıştır. Mikrodizi analizi ve RNA sekanslama teknolojileri, rejenere olan uzuvun farklı fazlarında diferansiyel olarak eksprese edilen (DE) genleri tespit etmek için en yaygın kullanılan transkriptomik araçlardır. Her ne kadar bu çalışmalar ile rejeneratif süreçte yer alan birçok önemli gen ve yolak bulunmuş olsa da, elde edilen sonuçlar, farklı laboratuarların çalışma tasarımları nedeniyle deneylerinin istatistiksel gücünü zayıflatıp sonuçların tutarlılığını etkileyebilmektedir. Bu tezin amacı bu istatistiksel açığı kapatmak için, halka açık mikroarray ve RNA-Seq aksolotl verilerinin bütünleştirici bir analizini yapmaktır. Analiz için üç biyolojik grup tasarlanmıştır; kontrol grubu (sağlam doku), yara iyileşme grubu (amputasyondan sonra yaklaşık 50 saate kadar) ve rejeneratif grup (amputasyon sonrası 50 saat ile 28 gün arası). Mikroarray ve RNA-Seq verilerinin bütünleştirici analizini ayrı ayrı yapmak için çapraz platform normalleştirme (birleştirme) yöntemi seçilmiştir. DE analizi, her iki teknolojiden veri işlendikten sonra R / Bioconductor `limma` paketi kullanılarak ayrı ayrı gerçekleştirildi. Yapılan karşılaştırmalarda sırasıyla, yara iyileşmesi grubu vs. kontrol de 91 gen, rejeneratif grup vs. kontrol grubunda 351 gen, ve rejeneratif grup vs. yara iyileşmesi grubunda 280 gen istastiksel olarak kuvvetli anlamlı bulunmuştur (düzeltilmiş p değeri; p<0.01). Detaylı analizler, biyolojik gruplar arasında, her iki teknolojinin içinde ve arasında bulunan DE gösteren genler logaritmik kat değişiklikleriyle tutarlı bir korelasyon sergilemiştir. Gen ontolojisi analizleri, sonuçlarımızın aksolotl uzuv yara iyileşmesinde ve yenilenmesinde literatürle uyumlu olduğunu göstermiştir. Geliştirdiğimiz metadoloji aksolotl ekstremite rejenerasyonu üzerine yapılacak gelecek çalışmalara gelişmiş istatistiksel güç ve daha tutarlı sonuçlar için faydalı olabilecektir.

Axolotl is a member of the urodele amphibians that exhibits extraordinary regenerative and scarless wound healing capabilities, fully restoring a lost limb as well as efficiently healing a damaged one. Axolotl has recently been used as a powerful experimental model for the fields of regenerative biology and medicine. Several studies have employed high-throughput, omics-based approaches to uncover the regenerative cues of the axolotl limb en masse. Microarrays and RNA-Sequencing technologies have been the most commonly used transcriptomic tools for detecting differentially expressed (DE) genes in different phases of the regenerating limb. Although those studies have found many important genes and pathways that are implicated in the regenerative process, the obtained results may lack sufficient consistency due to study designs originating from different labs, which undermines the statistical power of their experiments. Therefore, to bridge this statistical gap, the aim of this thesis was to perform an integrative analysis of publicly available microarray and RNA-Seq data from Axolotl limb samples having comparable study designs. Three biological groups were conceived for the analysis; control group (intact tissue), wound healing group (up to around 50 hours post amputation), and regenerative group (from 50 hours to 28 days post amputation). Cross-platform normalization (merging) method was selected for separately performing the integrative analysis of microarray and RNA-Seq data from Axolotl limb samples. Differential expression analysis was separately carried out using the R/Bioconductor `limma` package after processing data from both technologies. We found 91 genes, 351 genes, and 280 genes as the top DE genes which showed adjusted p <0.01 from data of both technologies in wound healing vs. control, regenerative vs. control, and regenerative vs. wound healing, respectively. Detailed analyses showed consistent correlation of the logarithmic fold changes of the differentially expressed genes distributed among the biological comparisons, within and between both technologies. Gene ontology annotations demonstrated concordance with the literature on the biological processes involved in the axolotl limb wound healing and regeneration. Future studies on axolotl limb regeneration may benefit from the utilized methodology for enhanced statistical power and more consistent results.