Karaca mersini(Acipenser gueldenstaedtii)solungacından karbonik anhidrazın karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada Karaca Mersini'nin (Acipenser gueldenstaedtii) dokularında karbonik anhidraz (CA) enzimi karakterize edildi. Balığın kalp, beyin, solungaç homojenatlarında ve eritrosit hemolizatında karbonik anhidrazın hidrataz aktivitesi sırasıyla 2,5, 7,4, 5,2, 10,8 EU/mg protein olarak belirlendi. Balığın solungacından karbonik anhidraz enzimi Sepharose-4B-L tirozin-sülfanilamid kolonunda 66 kat ve 20,7 verimle saflaştırılarak spesifik aktivitesi 222,2 EU/mg protein olarak tespit edildi.Enzimin saflığına sodyum dodesilsülfat poliakrilamid (SDS-PAGE) jel elektroforezinde gözlenen tek protein bandı ile karar verildi. SDS-PAG Elektroforezi sonucunda Karaca Mersini solungaçlarından saflaştırılan karbonik anhidrazın altbirim molekül kütlesi yaklaşık olarak 20 kDa olarak bulundu. Enzimin p-nitrofenil asetat substratı varlığında esteraz aktivitesinin pH 6,0'da ve 40 oC sıcaklıkta en yüksek olduğu tespit edildi. Solungaç karbonik anhidrazının Km ve Vmax kinetik değerlerini p-nitrofenol asetat (p-NFA) substratı kullanılarak Lineweaver-Burk grafiğinden hesaplandı ve KM 2,5 mM ve Vmaks 5x106 ? M/dak olarak belirlenmiştir. Enzimin p-NFA'a karşı etkinliğini belirten kcat değeri 134408,6 s-1 ile kcat/KM değeri 53763,4 mM-1s-1olarak bulundu. Solungaç CA'sının sülfanilamid ve asetazolamid inhibitörlerine karşı 13 ve 0,1 ? M gibi oldukça düşük IC50 değerine sahip olduğu tespit edildi. Ayrıca enzimin Zn+2 ile Ba+2 varlığında 1,1 mM, Fe+2 varlığında 0,2 mM, Co+2 varlığında 1,7 mM ve Ni +2 varlığında 1,2 mM IC50 değerleriyle inhibe olduğu belirlendi.Anahtar Kelimeler: Karbonik anhidraz, Karaca Mersini balığı, Acipenser gueldenstaedtii

In this study, carbonic anhydrase enzymes (CA) from Russian Sturgeon Fish (Acipenser gueldenstaedtii) tissues have been characterized. The hydratase activity of carbonic anhydrase in extract from heart, brain, gill and erythrocyte hemolyzates of the fish was determined as 2.5, 7.4, 5.2, 10.8 EU / mg protein, respectively. Carbonic anhydrase from the fish gill was purified 66-fold, as yield 222.2, and specific activity 20.7 EU / mg protein using Sepharose-4B-L tirosine-sulfanilamide affinity column.The purity of the enzyme was decided to be observed a single protein band on sodium dodesilsülfat polyacrylamide gel (SDS-PAGE) electrophoresis. As a result of SDS-PAG electrophoresis; the purified carbonic anhydrase in the gills of Russian Sturgeon Fish (Acipenser gueldenstaedtii) subunit molecular mass is about 20 kDa. Esterase activity of the enzyme in the presence of the substrate p-nitrophenyl acetate, was found to be the highest at pH 6.0 and a temperature of 40°C. KM and Vmaks kinetic values for gill carbonic anhydrase was calculated by a Lineweaver-Burk graph using p-nitrophenol acetate (p-NPA) as a substrate, and was defined as 2.5 mM and 5x106 ? M/min, respectively. Kcat and Kcat/KM values indicating that the enzyme the effectiveness of against p-NFA were found as 134408.6 s-1 and 53763.4 mM-1s-1. CA from its gill has very low IC50 values such as 13.0 and 0.1 ? M in the presence of the sulfanilamide and acetazolamide as inhibitors, was found. In addition, the enzyme were determined to be inhibited with the IC50 values as 1.1 mM in the presence of Zn +2 and Ba +2, 0.2 mM in the presence of Fe +2, 1.7 mM in the presence of Co +2 and 1.2 mM in the presence of Ni +2.Key words: Carbonic Anhydrase, Russian Sturgeon, Acipenser gueldenstaedtii