Diospyros kaki yaprak ve meyve özütlerinin gram (+) replikatif dna polimeraz (POLC) üzerine inhibisyonunun araştırılması

Abstract

Diospyros kaki (D. kaki) bitkisinin replikatif DNA polimeraz inhibisyonu, antimikrobiyal aktivitesi ve bazı kimyasal içeriklerinin çalışıldığı bu yüksek lisans tezinde bitkinin yaprak ve meyve kısımları kullanıldı. Replikatif bakteriyal DNA polimeraz olarak Bacillus subtilis (B. subtilis) replikatif DNA polimeraz IIIα (PolC) seçildi. Rekombinant üretim aşaması PolC'yi kodlayan genin PZR ile çoğaltılması ve pET-100 TOPO vektörüne klonlanmasıyla sağlandı. Rekombinant protein E. coli BL21 hücrelerinde üretildi ve Nikel Affinite kromotografi kullanırak saflaştırıldı. İnhibisyonun belirlenmesi için primer uzatma deneylerinde kullanılmak üzere bitkinin meyve ve yapraklarının metanol ve DMSO özütleri hazırlandı. Hazırlanan metanol özütleri PolC'ye karşı kullanıldı. Primer uzatma deneylerinde florojenik primer ihtiva eden ve sentetik olarak dizayn edilen 45/20-mer DNA kullanıldı. Diospyros kaki bitkisinin yaprak özütünün PolC üzerinde güçlü bir şekilde inhibisyon gösterdiği gözlemlenirken meyve özütünün ise PolC üzerinde inhibisyon etkisi göstermediği belirlendi. Hazırlanan DMSO özütleri ise antimikrobiyal aktivite için kullanıldı. Diospyros kaki yaprak özütlerinin hem Gram (-) hemde Gram (+) olmak üzere iki grup bakteri üzerinde de antimikrobiyal aktiviteye sahip olduğu tespit edildi. D. kaki bitkisinin inhibisyon görülen yapraklarından eter ve metanol özütlerinin HPLC-DAD ile fenolik bileşikleri aydınlatıldı. D. kaki bitkisi yaprak özütlerinde rutin türevleri ve kamferol bulundu.

In this thesis, inhibition of DNA replicative polymerase activity, antimicrobial activity and chemical content of Diospyros kaki (D. kaki) were studied and its fruit and leaf extract were used. Bacillus subtilis (B. subtilis) replicative DNA polymerase IIIα (PolC) was used a model polymerase in assays. The gene encoding PolC was amplified by PCR and cloned into pET-100 TOPO vector to produce recombinant protein. Expression was achieved in E. coli BL21 and the recombinant protein was purified by using nickel affinity chromatography. In order to determine inhibition, methanol and DMSO extract of fruit and leaf of D. kaki were prepared. Methanol exctract was used for determination of inhibition effect on PolC. In the primer extension experiments, synthetic designed 45/20-mer DNA which contains fluorogenic primer was used. It is observed that, leaf extract of D. kaki plant has strong inhibition on the contrary fruit exctract on PolC. Prepared DMSO extract was used to determine antimicrobial activity. It is concluded that, leaf extract of D. kaki has antimicrobial activity both Gram negative and Gram positive bacteria. Phenolic compounds of leaves of D. kaki were obtained ether and methanol extracts by using HPLC-DAD. Finally, routine derivatives and kaempferol were found in the leaf extract of D. kaki.