Anoxybacillus gonensis g2t glukoz izomerasının kinetik ve bazı biyokimyasal parametrelerinin g33d, n138g, t144s, v293ı, v32ı, e373k ve v380ı bölge spesifik mutasyonları ile geliştirilmesi

Abstract

Glukoz izomeraz, amilaz ve proteaz ile birlikte dünyanın en yüksek tonajlı üç enziminden birisidir. GI; D-glukozun D-fruktoza, D- ksilozun da D- ksiluloza dönüşümlü izomerizasyonunu katalizler. GI, D-glukozun D-fruktoza izomerizasyonu HFCS üretiminde ticari bir öneme sahiptir. Bu öneminden dolayı bugüne kadar pek çok hücreden yeni GI'lar izole edilerek karakterize edilmiştir. Anoxybacillus gonensis G2T glukoz izomerazını kodalayan gen pET-28a(+) ekspresyon vektörüne klonlanarak enzim rekombinant olarak üretildi ve saflaştırıldı. Enzimin biyokimyasal özellikleri, kinetik parametrelerinin geliştirilmek için glukoz izomeraz üzerinde G33D, N138G, T144S, V293I, V32I, E373K ve V380I mutasyonları yapıldı. Mutant enzimler ve yaban tip enzim, kolon kromatografisi yöntemleri ile saflaştırıldı. Karakterize edilen tüm enzimler biyokimyasal özellikleri ve kinetik parametreleri bakımından birbirleriyle ve yaban tip enzim ile karşılaştırıldı. Yapılan karakterizasyon çalışmaları sonucunda G33D, V293I, V32I, E373K ve V380I mutasyonları ile yaban tip enzimin biyokimyal özelliklerinde ve kinetik parametrelerinde önemli sayılabilecek bir değişiklik meydana gelmemiştir. N138G ve T144S mutant enzimlerin Vmax, kcat ve katalitik etkinlik değeri olan kcat/ Km 'sinde artış gözlendi. N138G'nin Vmax değeri 44,24 ± 0,27 µmol/dk/mg protein, T144S'nin Vmax değeri 34,59 ± 0,26 µmol/dk/mg protein olarak hesaplandı. G33D, T144S mutant enzimlerin ısıl kararlılığında yaban tip enzime göre hafif bir artış gözlendi.

Glucose isomerase is one of the three highest tonnaged enzymes with along amylase and protease in the World. Glucose isomerase catalyses conversion isomerization of D-glucose to D-fructose, and D-xylose to D-xylulose. Isomerization of D-glucose to D-fructose has a commercial importance in the production of HFCS. Because of this importance, many new GIs have been isolated and characterized to date. The coding gene of glucose isomerase from Anoxybacillus gonensis G2T was cloned to pET-28a(+) vector and GI was produced and characterized. To improve biochemical properties and kinetic parameters of the enzyme, G33D, N138G, T144S, V293I, V32I, E373K and V380I mutations were performed on the wild-type enzyme by site directed mutagenesis. All mutant enzymes and wild-type enzyme were purified by column chromatography methods. All characterized enzymes were compared with each other and with wild-type enzyme in terms of their biochemical and kinetic parameters. As a result of the characterization studies, mutations of G33D, V293I, V32I, E373K and V380I did not give any significant change in the biochemical properties and kinetic parameters of the wild-type enzyme. An increase was observed in the Vmax, kcat, and kcat/ Km values of the wild-type enzyme by N138G and T144S mutantations. The Vmax value of N138G mutant enzyme was calculated as 44,24 ± 0,27 μmol / min / mg protein and the Vmax value of T144S as 34,59 ± 0,26 μmol / min / mg protein. Increases were observed in the thermal stability of the G33D and T144S mutant enzymes compared to wild-type enzyme.