Termofilik Anoxybacillus flavithermus DSM 2641T bakterisinin ptps geninin klonlanması, ekspresyonu ve enzimin biyokimyasal karakterizasyonu

Abstract

Fenilketonüri (FKÜ), yenidoğan bebeklerde fenilalanin hidroksilaz enzim yetersizliğinden kaynaklanan ve tedavi edilebilir zekâ geriliklerinin en önemli nedeni olan bir hastalıktır. Hastalığın nedenlerinden biri de, bu metabolik yolakta yer alan PTPS enzimine ait kusurlardan ileri gelir. Hastalığın tedavisi mümkün olmayıp, kronik hastalarda ömür boyu tetrahidrobiopterin yüklemesi yapılmaktadır. Günümüzde tetrahidrobiopterin maddesi kimyasal olarak sentezlenmektedir. Kimyasal sentezin uzun sürmesi, masraflı olması ve de kimyasal kirleticilere maruz kalması nedeniyle biyolojik olarak üretim farklı bir bakış açısıdır. Bu nedenle, termofilik Anoxybacillus flavithermus DSM 2641T bakterisine ait ptps geni PZR yöntemiyle tespit edildi ve pET28a(+) ekspresyon vektörüne klonlandı. E. coli BL21(DE3)pLys konak hücresinde gerçekleştirilen ekspresyon sonrasında Ni-NTA afinite kromatografisi ile saflaştırıldı. Enzime ait biyokimyasal ve kinetik parametreler, ters faz HPLC sistemi ile belirlendi. Yapılan çalışmalar sonucunda 438 bç'lik genin, 145 amino asitlik 17 kDa büyüklüğünde bir enzimi ürettiği görüldü. Enzimin optimum pH'sı 8,8, optimum çalışma sıcaklığı ise 65C olarak belirlendi. Sepiapterin dönüşüm aktivitesi bulunmayan enzimin, NTP-H2 aktivitesinde ise maksimum hızı (Vmax) 0,0081 ± 0,00017 μmol/dak/mg protein ve Km'si ise 0,261 ± 0,007 mM olarak belirlendi. Yapılan çalışmalarda 5 mM K+'un % 9, 10 mM Ca+2'nin % 5 oranında aktiviteyi arttırdığı, 1, 5, 10 mM Al+3'ün % 2, 1 mM Zn+2'nin % 5,5 oranında, 5 mM DTT'nin ise % 50 inhibe ettiği bulundu.

Phenylketonuria (FKU) is a disease caused by phenylalanine hydroxylase enzyme deficiency in newborn infants and is the most important cause of treatable mental retardation. One of the causes of the disease comes from the defects of the PTPS in the metabolic pathway of phenilalanine metabolisms. Treatment of the disease is not feasible, and life-time tetrahydrobiopterin loading is performed in chronic patients. Today, tetrahydrobiopterin is chemically synthesized. Biological production is a different point of view due to the long duration of chemical synthesis, costs and exposure to chemical pollutants. For this reason, the ptps gene from the thermophilic Anoxybacillus flavithermus DSM 2641T was identified by PCR method and cloned into the expression vector, pET28a(+). After the gene expression in E. coli BL21(DE3)pLys host cells, the enzyme was purified by Ni-NTA affinity chromatography. Biochemical and kinetic parameters of the enzyme were determined by reverse phase HPLC system. As a result of the studies, it was seen that the genome of 438 bp produced an enzyme with a size of 17 kDa of 145 amino acids. The optimum pH of the enzyme was determined as 8.8 and the optimum temperature was 65°C. The maximum rate (Vmax) and Km for NTP-H2 activity 0.0081 ± 0.00017 μmol/min/mg protein and 0.261 ± 0.007 mM, respectively. The enzyme has not sepiapterin convertion activity. In the studies, 5 mM of K+ and 10 mM of Ca+2 were increased the enzyme activity as 9% and 5%, although 1, 5, and 10 mM of Al+3, 1 mM of Zn+2, and 5 mM DTT were inhibited as 2%, 5.5%, and 50%, respectively.