Termofilik anoxybacillus amylolyticus bakterisinin gchı geninin klonlanması ve enzimin biyokimyasal karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışma, fenilketonüri metabolizmasında görevli birinci enzim olan GTP siklohidrolaz I'in termofilik Anoxybacillus amyloliticus bakterisinden klonlanmasını, ekspresyonunu ve enzimin saflaştırılarak biyokimyasal karakterizasyonunu içermektedir. A. amyloliticus bakterisinden PZR ile tespit edilen gchI geni 561 baz çifti büyüklüğünde toplam 186 amino asidi kodlayan tek bir açık okuma dizisidir. GTP'den dihidroneopterin trifosfat dönüşümünü katalizleyen enzim gen ekspresyonu pET28a(+) vektörüne klonlandıktan sonra E. coli BL21(DE3)pLysS hücresinde 1 mM IPTG ile indüksiyonu sağlandı. Enzimin saflaştırılması için Ni-NTA afinite kolonu kullanıldı. Yapılan karakterizasyon çalışmaları sonucunda enzimin Vmax'ı 6,9x10-5 ± 2,3x10-4 µM/dk/mg protein ve Km'si 7,0 ± 1,4 mM olarak bulundu. Enzim en iyi aktivite gösterdiği sıcaklık değeri 70C ve en uygun pH değeri ise 7,0 olarak belirlendi.

This study was included the cloning, expression and biochemical charactreization of gchI that was coded the first enzyme responsible for fenilketonuria pathway, from thermophilic Anoxybacillus amyloliticus. This gene was 561 basepairs by detected PCR and its open reading frame has 186 amino acids. This enzyme catalyzed from GTP to dihydroneopterin triphosphate. We cloned into pET28a(+) expression vector and transform in E. coli BL21(DE3)pLysS host cells to express with 1 mM IPTG induction. The purification of the enzyme was achieved by Ni-NTA affinity column chromatography. We determined that its optimum pH was 7.0 and temperature is 70°C. Under optimal conditions, GCH-I exhibited a low enzymatic activity with Km- and Vmax- values of 7.0 ± 1,4 mM and 6,9x10-5 ± 2,3x10-4 µM/dk/mg protein, respectively..