UnaG proteini varyantının (R112/132Q) rekombinant dna teknikleriyle üretilmesi

Abstract

Japon tatlı su yılanlarından (Anguilla japonica) izole edilen UnaG, omurgalılarda tanımlanan ilk floresan proteindir. Bilinen diğer proteinlere nazaran birçok avantaja sahip olan ve kendisine yağ asidi bağlayıcı proteinler arasında yer bulan UnaG, spesifik bir ligandla birleşerek UV ışık altında uyarılabilmektedir. Bu protein konjuge olmayan bilirubinle nonkovalent şekilde yüksek özgünlük ve afinitede florojenik ligand oluşturmak üzere bağlanır. Oluşan UnaG-BR kompleksi (holoUnaG), UV ışık altında yeşil floresan ışıma göstermektedir. Söz konusu çalışmada polar rezidülerin yükü ortadan kaldırılarak floresans ligandın çevresinin değiştirilmesi amaçlanmıştır. R112/R132' nin glutamine dönüştürülmesini içeren mutasyon Quik Change Site Directed yöntemi kullanılarak yapılmıştır. Gerçekleştirilen mutasyonun doğruluğu saflaştırılan plazmitin DNA dizileme sonucunda belirlenmiştir. Ardından ekspresyon çalışmaları yapılmış ve bunun için E. coli' nin C41 suşu kullanılmıştır. Ekspresyon çalışmalarıyla üretilen UnaG varyantı, SDS-PAGE analiz edilerek doğrulanmıştır. UV-Vis absorbans, bilirubin titrasyonu gibi spektroskopik ölçümler yapılarak üretilen UnaG varyantının bilirubine karşı yüksek bir afiniteye sahip olduğu görülmüştür. Elde edilen bu varyant UnaG proteini ileriki çalışmalarda bilirubin biyosensörlerin geliştirilmesiyle günümüzde var olan bilirubin ölçüm metodlarına alternatif olacak çok daha etkili bir bilirubin tayin yöntemi kapsamında kullanılabilecek aday moleküllerden biri olmuştur.

UnaG is the first fluorescent protein identified in vertebrates isolated from Japanese freshwater eel (Anguilla japonica). UnaG, which has many advantages over other known proteins and is among the fatty acid binding proteins, can be stimulated under UV light by combining with a specific ligand. This protein binds noncovalently to un-conjugated bilirubin and form a with high specificity and affinity fluorogenic ligand. The resulting UnaG-BR complex (holoUnaG) shows green fluorescence under UV light. In this study, it was aimed to change the circumference of fluorescence ligand by eliminating the charge of polar residues. The mutation involving the conversion of R112 / R132 to glutamine was made using the Quik Change Site Directed method. The accuracy of the mutation performed was determined by DNA sequencing of the purified plasmid. Then, expression studies were performed and E. coli strain C41 was used for this purpose. The UnaG variant produced by expression studies was confirmed by SDS-PAGE analysis. UV-Vis absorbance, bilirubin titration and spectroscopic measurements showed that the UnaG variant has a high affinity to bilirubin. This variant UnaG protein has become one of the candidate molecules that can be used in the context of a more effective bilirubin determination method which will be an alternative to the current bilirubin measurement methods by the development of bilirubin biosensors in future studies.