Varyant UnaG proteinlerinin geliştirilmesine yönelik protein mühendisliği uygulamaları

Abstract

Floresan proteinler, biyomühendislik, biyoloji ve biyoteknoloji alanında hücredeki olayları ve molekülleri görselleştirme, takip etme ve nicellendirme için işaretleyici ajan olarak yaygın bir şekilde kullanılan genetik olarak kodlanmış raportörlerdir. UnaG proteini tatlı su yılan balığı larvalarından izole edilmiş bir floresan proteindir. Heterolog ekspresyon sistemlerinde füzyon olarak ifade edilen bu protein, diğer floresan proteinlerden farklı olarak biyolojik bir ligand (konjuge olmayan bilirubin) ile aktif hale gelen bir floresan proteindir. UnaG proteini yalın haliyle (ApoUnaG) floresan emisyonu göstermez, ancak bilirubin ile birleştirildiğinde (HoloUnaG) sarı-yeşil bir floresan üretir. Bilirubin, esas olarak vücuttaki eritrositlerin yok edilmesiyle Heme katabolizmasından üretilen bir tetrapirol moleküldür. Kan plazmasındaki bilirubin seviyesinin yükselmesi durumuna hiperbilirubinemi denir. Bilirubin, beyin dokusuna geçişi ile yeni doğanlarda kalıcı nörolojik hasar ile ilişkili ciddi bir durum olan kernikterus hastalığına neden olabilir. Plazma bilirubin analizi ve miktar tayini için farklı yöntemler geliştirilmiştir. Bilirubin tarafından tetiklenen UnaG floresan proteininin kullanımı, plazma bilirubin analiz çalışmalarında yeni bir yaklaşım haline gelmiştir.Bu çalışmada, UnaG proteininin amino asidi dizisi üzerinde mutasyonlar (F17M, F17Y, L41F, N57D, N57E, N57R, T61A_T37A, T61S_T37S, T61V_T37V, Y99F_Y134W, Y99M_Y134M ve W9F_W103F) sonucu elde edilen proteinlerle ligand etkileşimlerinin biyofiziksel karakterizasyonunun araştırılması amaçlanmıştır. İfade edilen proteinlerin saflık seviyeleri SDS PAGE ile analiz edildikten sonra, proteinlerin ikincil yapıları ve termal açılma sıcaklıkları dairesel dikroizm spektroskopisi ile incelenmiştir. Ayrıca her bir varyant için, floresans spektroskopisi ile uyarma ve emisyon noktaları belirlenmiş, bilirubin ile titrasyon çalışmaları yapılmış ve ayrışma sabitleri hesaplanmıştır. Biyofiziksel karakterizasyon çalışmalarına göre, T61S_T37S varyantı ölçülebilir seviyede bir floresan ışıma gösterdiği, en yüksek termal stabiliteye ve yabanıl tip UnaG'dan daha fazla afiniteye sahip olduğu için olası bir bilirubin biyosensöründe kullanılabilecek favori bir varyant olarak seçilmiştir.

Fluorescent proteins are genetically coded reporters, which are widely used as marker agents for visualizing, tracking and quantifying cell events and molecules in the field of bioengineering, biology and biotechnology. UnaG protein is a recently discovered fluorescent protein isolated from freshwater eel larvae. This protein, expressed as a fusion in heterologous expression systems, is a fluorescent protein that is being activated with a biological ligand (unconjugated bilirubin), unlike other fluorescent proteins. UnaG protein does not show fluorescent emission in its simple form (ApoUnaG), but when combined with bilirubin (HoloUnaG) it produces a yellow-green fluorescence. Bilirubin is a tetrapyrrole molecule mainly produced from Heme catabolism by the destruction of erythrocytes in the body. The abnormally raised level of bilirubin in blood plasma is called hyperbilirubinemia. Bilirubin can cause kernicterus, a serious condition associated with permanent neurological damage in neonates with its transition of brain tissue. Different methods have been developed for plasma bilirubin analysis and quantification. The use of UnaG fluorescent protein triggered by bilirubin has become a new approach in plasma bilirubin studies.In this study, we aimed to investigate the biophysical characterization of ligand interactions with the proteins obtained as a result of mutations (F17M, F17Y, L41F, N57D, N57E, N57R, T61A_T37A, T61S_T37S, T61V_T37V, Y99F_Y134W, Y99M_Y134M ve W9F_W103F) on the amino acid sequence of UnaG protein. After the purity levels of the expressed proteins were analysed by SDS PAGE, secondary structures and thermal melting temperatures of the proteins were examined by circular dichroism spectroscopy. Thereafter, for each variant, the excitation and emission points were determined by fluorescence spectroscopy, titration studies were performed with bilirubin, and the dissociation constants were calculated. Based on the biophysical characterization studies, the T61S_T37S variant was chosen as a favourite variant that could be used in a possible bilirubin biosensor, as this variant demonstrated a measurable fluorescent emission, the highest thermal stability and greater affinity than wild type UnaG.