İnvertaz ve polifenol oksidaz enzimleriyle oluşturulan karbon fiber enzim elektrotları

Abstract

Bu çalışmada yeni bir elektrot malzemesi olarak karbon fiber kullanıldı. İnvertaz ve polifenol oksidaz enzimleri elektrot malzemesi olarak karbon fiberin kullanıldığı elektrotlara immobilize edilerek karbon fiber enzim elektrotları oluşturuldu. Bu elektrotlar laboratuvarda hazırlanan karbon fiber elektrotlar üzerine elektrokimyasal polipirol polimerizasyonu esnasında enzimin immobilizasyonuyla elde edildi. İmmobilize enzimin kinetik parametreleri, Vmax (maksimum reaksiyon hızı) ve Km (substratın enzim ilgisi) tayin edildi. Bu değerler invertaz enzimi için sırasıyla 0,779 ± 0,120 μmol/dak.elektrot ve 27,20 ± 6,70 mM olarak, polifenol oksidaz enzimi için 0.017 ± 0.004 μmol/dak.elektrot ve 176,00 ± 26,60 mM olarak bulundu. Reaksiyon koşullarının enzim aktivitesine etkisi incelendi; immobilize invertazın optimum sıcaklığı ve pH'ı, 40 ℃ ve pH 6,0 olarak, polifenol oksidazın ise 60 ℃ ve pH 7,0 olarak tespit edildi. Doğrusal çalışma aralığı, invertaz ve polifenol oksidaz için sırasıyla 0,0034 M – 0,0500 M ve 0,035 M – 0,400 M'dır. Aktivite ölçümlerinin ardışık stabilitesi ve raf ömrü saptandı. İmmobilize invertazın aktivitesi 37 ardışık ölçümden sonra %70 olarak belirlendi, bu değer immobilize polifenol oksidaz için de 19 ardışık ölçümden sonra %70'dir. Raf ömrü çalışmasında, invertaz elektrodu için 42 gün sonra aktivite %25 kayıpla %75 olarak gözlendi. Polifenol oksidaz elektrotları için 40 gün raf ömrü ölçümleri yapıldı. Aktivitenin gitgide arttığı ve 40. günde daha bir yüksek değere ulaştığı görüldü. Gözlenebilme sınırı (LOD) ve tayin sınırı (LOQ) değerleri invertaz immobilize elektrotlar için 0,0034 M, 0,01126 M, polifenol oksidaz immobilize edilmiş elektrotlar için 0,0353 M, 0,1170 M olarak tespit edildi. Sonuçlar daha önceden yapılmış çalışmalarda bulunan platin elektrot ve polipirolde immobilize edilmiş enzim çalışmalarıyla karşılaştırıldı. Enzim elektrotları gerçek numunelerde denendi. Siyah çayın suda ekstraksiyonuyla elde edilen numunelerde polifenol analizi yapıldı.

In this study, carbon fiber was used, as a new electrode material. Carbon fiber enzyme electrodes were prepared by immobilization of invertase and polyphenol oxidase enzymes on the electrodes of carbon fiber. The electrodes were obtained by immobilization of enzyme in the conductive polypyrrole polymer matrix during electrochemical polymerization of pyrrole onto laboratory–made carbon fiber electrodes. Kinetic parameters of immobilized enzyme, Vmax (Maximum reaction rate) and Km (substrate affinity) were determined. Vmax and Km values for invertase were 0.779 ± 0.120 μmol/min.electrode and 27.20 ± 6.70 mM, for polyphenol oxidase 0.017 ± 0.004 μmol/min.electrode and 176.00 ± 26.60 mM respectively. The influence of conditions on enzyme activity was investigated; optimum temperature and pH were found as 40 ℃ and pH 6.0 for immobilized invertase, 60 ℃ and pH 7.0 for immobilized polyphenol oxidase. Lineer working ranges were 0.0034 M - 0.0500 M and 0.035 M - 0.400 M for invertase and polyphenol oxidase respectively. Stability in consecutive measurements and shelf life were obtained. For invertase electrode, 70% activity was observed after 37 consecutive measurements, this is again 70% for poliphenol oxidase electrode after 19 consecutive measurements. In shelf life investigation, it was observed that 25% of activity was lost and 75% retained after 42 days for invertase electrode. For polyphenol oxidase electrode 40 days shelf life study was performed. It was seen that activity increased steadily and reached a high value at 40th day. Detection limit (LOD) and quantitation limit (LOQ) values were 0.0034 M and 0.01126 M for electrodes of immobilized invertase, 0.0353 M and 0.1170 M for electrodes of immobilized polyphenol oxidase. The results were compared with the previous studies in which enzyme was placed in polypyrrole coated platinum electrodes. Enzyme electrodes were tried by measurements of real samples. It was performed analysis of polyphenolics in the samples that were obtained by water extraction of black tea.