Presenilin 2 cDNA`sının klonlanması ve ailesel alzheimer hastalığı patogenezinde etkin mutasyonları taşıyan vektörlerin oluşturulması

Abstract

Yapılan bu çalışmayla pcDNA3 vektörünün SmaI restriksiyon enzimi kesimnoktası içine daha önceden klonlanmış olan Presenilin 2 geninin cDNA'sı BamHI veKpnI restriksiyon enzimleri ile kesilerek çıkarılmış, aynı restriksiyon enzimlerininkesim noktalarını taşıyan pBluescript II SK (+) vektörüne klonlanmıştır. Klonlananvektör ile transform edilen XL-1 Blue E. Coli hücreleri LB/Agar katı besiyerindeüretilerek pozitif koloniler seçilmiştir. Seçilen pozitif kolonilerden plazmid DNA'sıizole edilmiş ve dizi analizi ile klonlamanın gerçekleştirildiği gösterilmiştir.Klonlanan cDNA dizisi üzerinde yönlendirilmiş mutagenez ile Ala252Thr vePro334Arg mutasyonları oluşturulmuş ve XL-1 Blue hücreleri mutant cDNA dizisitaşıyan vektörlerle transform edilerek, bu vektörleri taşıyan saf kültürler eldeedilmiştir. İleride Haliç Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Laboratuvarındayapılacak olan hücre kültürü çalışmalarında söz konusu mutasyonların etkilerininçalışılabilmesi için gerekli vektörel alt yapı sağlanmıştır.

In this study, cDNA of Presenilin 2 gene which has been cloned to the SmaIrestriction enzyme site of pcDNA3 was cut out by BamHI and KpnI enzymes. ThecDNA fragment was further inserted between the BamHI and KpnI sites of thepBluescript II SK (+) vector. XL-1 Blue E.coli cells were transformed with thevector and positive colonies on LB/Agar medium were selected to plasmid DNAisolation. The tranformation was confirmed by DNA sequence analysis.The cloned cDNA sequence was changed by site-directed mutagenesis method toconstruct vectors carrying Ala252Thr and Pro334Arg mutations. The XL-1 Bluecells were transformed by the mutant clones to obtain pure colonies. As a result ofthis study, useful vector constructs were created in Halic University, MolecularBiology and Genetics Laboratory, which will be essential in the future studies forinvestigating the effects of the Presenilin 2 mutations in cell cultures.