Presenilin 1 cDNA`sının klonlanması ve ailesel alzheımer hastalığı patogenezinde etkin mutasyonları taşıyan vektörlerin oluşturulması

Abstract

Bu çalışmada pcDNA3 vektörü üzerinde bulunan Presenilin 1 geninin cDNA'sı BamHI ve XbaI restriksiyon enzimleri ile kesilerek çıkarılmış, ve pBluescript II SK (+) vektörünün çoklu klonlama bölgesinde yer alan BamHI ve XbaI kesim noktaları arasına klonlanmıştır. Klonlanan vektör ile transform edilen XL-1 Blue E. Coli hücreleri LB/Agar katı besiyerinde üretilerek beyaz koloni oluşturan pozitif koloniler plazmid izolasyonu için seçilmiştir. Transformasyonun gerçekleştirildiği ve plazmid üzerinde Presenilin cDNA'sı bulunduğu DNA dizi analizi ile gösterilmiştir.Klonlanan cDNA dizisi üzerinde yönlendirilmiş mutagenez ile Val89Leu ve Ile439Val mutasyonları oluşturulmuştur. XL-1 Blue hücreleri mutant cDNA dizisi taşıyan vektörlerle transform edilerek, mutant cDNA dizileri taşıyan saf kültürler elde edilmiştir. İleride Haliç Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Laboratuvarında yapılacak olan hücre kültürü çalışmalarında söz konusu mutasyonların etkilerinin çalışılabilmesi için gerekli vektörel alt yapı sağlanmıştır.

In this study, the cDNA of Presenilin 1 gene was cut out from pcDNA3 vector by BamHI and XbaI enzymes. The cDNA fragment was further inserted to the multiple cloning site of the pBluescript II SK (+) vector, between the BamHI and XbaI recognition sites. XL-1 Blue E.coli cells were transformed with the vector. The positive formed white colonies on LB/Agar medium and were selected for plasmid DNA isolation. The tranformation and the presence of Presenilin 1 cDNA on the vector was confirmed by DNAsequence analysis.The cloned cDNA sequnece was subjected to site-directed mutagenesis in order to construct vectors carrying Val89Leu and Ile439Val mutations. The XL-1 Blue cells were transformed by the mutant clones to obtain mutant colonies. As a result of this study, useful vector constructs were created in Halic University, Molecular Biology and Genetics Laboratory, which will be essential in the future studies for investigating the effects of the Presenilin 1 mutations in cell cultures.