Rekombinant Mycobacterium tuberculosis OmpA proteininin antijenik etkisinin araştırılması

Abstract

Bu çalışmada, insanlarda tüberküloz (TB) hastalığının en önemli etkeni olan Mycobacterium tuberculosis'e karşı dünya genelinde kullanılan BCG aşısına alternatif yeni rekombinant aşı üretimi için M. tuberculosis OmpA proteininin kullanılabilirliğinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Erişkin bireylerde dünya genelinde halen kullanılmakta olan BCG aşısının koruyucu etkisinin çok az olmasından dolayı yeni rekombinant TB aşılarının geliştirilmesine ihtiyaç duyulmaktadır. Ülkemizdeki bir verem hastasından izole edilmiş olan M. tuberculosis suşundan ompA geni ilk olarak pGEM-T, ardından pET28a vektörüne klonlandı. E. coli BL21 suşunda ifade edilen his-tag taşıyan rekombinant OmpA proteini nikel kolonlar kullanılarak saflaştırıldı. Rekombinant OmpA ve yağ bazlı bir adjuvan olan Montanide ISA 720 VG 7:3 oranında karıştırılarak aşı formülasyonu hazırlandı. Aşı formülasyonu, adjuvan ve BCG aşısı, 5 BALB/c fareye s.c. enjekte edildi. İlk enjeksiyondan önce, 15., 30., 41. ve 66. günlerde farelerden kuyruk kanı alınarak serum örnekleri toplandı. Rekombinant OmpA'nın antijenik özelliklerini kalitatif olarak göstermek için Western blot deneyi uygulandı. Rekombinant OmpA ve BCG aşısına özgün serum kullanıldığında beklenen büyüklükte bantlar gözlenirken, sadece adjuvana özgün serum kullanıldığında bant gözlenmedi. OmpA içeren aşı formülasyonunun BALB/c farelerdeki hümoral ve hücresel bağışıklığı tetikleme kapasitesi değerlendirildi. OmpA formülasyonunun serum IgG seviyesini anlamlı düzeyde artırdığı, serum IFN-γ düzeyini artırmada BCG kadar etkin olduğu, serum IL-12 düzeyini artırmada ise zayıf olduğu belirlendi. Rekombinant OmpA proteininin ikili veya üçlü füzyonlarının oluşturulması, CpG oligonükleotitleri gibi hücresel yanıtı artıran farklı adjuvanlar kullanılmasıyla, TB aşısı geliştirmede kullanılabileceği düşünülmektedir. Elde edilen bulgular ışığında OmpA aşı formülasyonunun akciğerde ve dalakta M. tuberculosis tutunmasını nasıl etkilediği ile ilgili koruyucu etki çalışmalarının da yapılması gerekmektedir.

In this study, it was aimed to investigate the potential of OmpA protein from Mycobacterium tuberculosis to be used for a new vaccine against M. tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB) disease in human. Development of new recombinant TB vaccines are needed because the BCG vaccine in use worldwide is low in protection among the adults. The ompA gene from M. tuberculosis isolated from a Turkish patient was cloned first in pGEM-T, and then pET28a vector. The his-tagged OmpA protein expressed in E. coli BL21 strain was purified using nickel columns. The vaccine formulation was prepared mixing the recombinant OmpA and an oil-based adjuvant Montanide ISA 720 VG in 7:3 proportion. The vaccine formulation, adjuvant, and BCG vaccine was s.c. injected to 5 BALB/c mice. The sera samples were collected from the tail blood collected pre-immunization, 15th, 30th, 41st, and 66th days post-immunization. Western blot experiment was applied to show the antigenic property of recombinant OmpA qualitatively. The desired molecular weight bands were detected when the sera from recombinant OmpA and BCG injected mice were used; however, no band was seen using the sera specific to adjuvant was used. The capacity of OmpA formulation to induce the humoral and cellular immune response in BALB/c mice was evaluated. It was shown that the OmpA formulation induced the serum IgG level significantly, efficient in induction of serum IFN-γ level as BCG; however, weak in induction of serum IL-12 level. Recombinant OmpA protein might be used in TB vaccine development using double or triple fusions with different proteins, or different adjuvants inducing cellular response, such as CpG oligonucleotides. It is needed to evaluate the the protection capacity of OmpA formulation via assaying the M. tuberculosis adhesion in lungs and spleen.