Farklı diabet tiplerinin vasküler reaktivitede oluşturduğu değişimler üzerinde endotel hücrelerinin rolü

Abstract

6.0. ÖZET Diabetes mellitus'un, vasküler reaktivitede oluşturduğu değişimleri araştırmak amacığla bu tez de üç farklı diabet tipi seçilerek, izole edilen damar preparatlarında in vitro olarak çeşitli agonistlerin etkileri denenmiş ve elde edilen bulgular nondiabetik kontroller ile karşılaştırışlmıştır. Çalışmamızda deneysel olarak oluşturulmuş Tip-1 ve Tip-2 diabetik sıçanlardan izole edilen aortalar ve koroner bypass operasyonu sırasında NIDDM'li hastalardan alınan İMA ve SV'ler kullanılmıştır. Bu tez kapsamında öncelikle, klinikteki IDDM'li hastaların özelliklerini taşıyan ve kuyruk veninden tek bir doz (50 mg/kg) alloksan injeksiyonu ile oluşturduğumuz 6-7 haftalık `insüline-bağımlı` yani Tip-1 diabetik sıçanlardan ve ayrıca, klinikteki NIDDM'li hastaların küçük bir grubunun gösterdiği karakteristik özellikleri taşıyan ve gene tek bir doz (100mg/kg) i.p. alloksan injeksiyonu ile oluşturduğumuz 13-14 haftalık `insüline-bağımlı olmayan` yani Tip-2 diabetik sıçanlardan izole ettiğimiz aorta halkalarında entotel hücreler intakt iken ve tahrib edildikten sonra NA ile stimüle edilen vazokonstriktör yanıtlar değerlendirilmiştir. Çalışmamızda NA'nin gerek kontrol ve gerekse diabetik aortalarda doza bağlı olarak vazokonstriksiyona neden olduğu; endoteli intakt Tip-1 diabetik sıçan aortasında NA'nin maksimal kontraktil yanıtının, endoteli intakt olan kontrollere oranla anlamlı olarak arttığı; endoteli tahrib edilmiş kontrol aortada endoteli intakt kontrol aortaya ve endoteli tahrib edilmiş Tip-1 diabetik aortada endoteli intakt olan Tip-1 diabetik aortaya oranla NA'nin maksimal kontraktil yanıtının anlamlı olarak daha fazla olduğu, bununla birlikte endotel hasarından sonra gerek kontrol ve gerekse Tip-1 diabetik aortada NA ile elde edilen maksimal kontraksiyonların birbirinden farklı olmadığı gösterilmiştir, öte yandan gerek kontrol ve gerekse Tip-1 diabetik aortada endotel varlığında ve endotel tahrib edildikten sonra NA'nin doz-yanıt eğrisinden hesaplanan pD2 değerlerinin değişmediğini gösterdiğimiz bu çalışmada-, ayrıca Tip-1 diabetik sıçanlara uygulanan in vivo insulin tedavisinin, bu sıçanların genel karakteistiklerinde ve NA'nin kontraktil etkisinde gözlediğimiz değişimleri kontroller doğrultusunda geri döndürdüğü de saptanmıştır. Tip-1 diabetik sıçan aortasında elde ettiğimiz bulgulara benzer şekilde, endoteli intakt Tip-2 diabetik sıçan aortasında da, NA ile stimüle edilen maksimal kontraktil yanıtların, endoteli intakt kontrollere oranla anlamlı olarak arttığı; pD2 değerlerinin ise değişmediği gözlenmiştir, öte yandan endotel hücreler tahrib edildikten sonra, kontrol aortada NA ile stimüle edilen maksimal kontraktil yanıtlar, endoteli intakt olan kontrollere oranla anlamlı olarak arttığı; buna karşın, endoteli tahrib edilmiş Tip-2 diabetik aortada endoteli intak olan Tip-2 diabetik aortaya oranla istatistiksel anlamlı olarak değişmediği bulunmuştur. Endotel tahrib edildikten sonra, kontrol ve Tip-2 diabetik aortada, NA'nin maksimal kontraktil yanıtının istatistiksel olarak farklı olmadığı ve pD2 değerlerinin değişmediği saptanmıştır. Bununla birlikte, in vivo insulin tedavisinin, Tip-2 diabetik sıçanlarda gözlenen ve yukarıda açıklanan değişimleri kontroller doğrultusunda geri döndürdüğü gösterilmiştir. öte yandan çalışmamızda Tip-1 diabetik aortada Ach, metakolin, 195histamin, ATP ve insulin ile stimüle edilen endotele-bağımlı gevşemelerin kontrollere oranla anlamlı olarak arttigx; buna karşın Tip- 2 diabetik aortada ise anlamlı olarak azaldığı bulunmuştur. Gerek Tip-1 ve gerekse Tip-2 diabetik aortada, A-23187 ile stimüle edilen endotele- bağımlı gevşemelerin ve SNP ile doğrudan düz kas stimülasyonuna bağlı olarak oluşan gevşemelerin kontrollere oranla değişmediği saptanmıştır, öte yandan, insülin ile tedavi edilen sıçanlarda, sözü edilen değişimlerin bütünüyle geri döndüğü gözlenmiştir. Tip-1 ve Tip-2 diabetik aortanın NA'ne yanıtverebilirliğinde saptadığımız artış, hiperglisemi, hipoinsülinemi ve diabetik nöropatinin bir fonksiyonu olarak, NA'nin kontraktil etkisinden sorumlu düz kastaki alfa-adrenerjik reseptörlerin duyarlığı değişmeden, sayısı ve/ veya aktiviteslndeki artışın ve post-reseptör yolaklardaki değişimlerin sonuçları olarak değerlendirilmekle birlikte aynı zamanda, endotel hücrelerde basal durumda ortaya çıkan disfonksiyonun, bu olayda rol oynadığı öne sürülmüştür. Tip-2 diabetik aortada gözlenen kontraktilite artışından ve endotele-bağımlı gevşemelerde saptanan azalmadan, yukarıda sayılan mekanizmalara ek olarak büyük olasılıkla, endotel hücre harabiyetinin sorumlu olduğu bildirilmiştir. öte yandan çalışmamızda, NIDDM'li hastalardan izole edilen endoteli intakt ve endoteli tahrib edilmiş İMA ve SV'lerde, NA'nin doza- bağlı olarak kontraksiyona neden olduğu; endoteli intakt diabetik İMA ve SV'de NA'nin maksimal kontraktil yanıtlarının ve pD2 değerlerinin endoteli intakt nondiabetik kontrollere oranla anlamlı olarak arttığı; bununla birlikte, endotel tahrib edildikten sonra, NA ile stimüle edilen maksimal kontraksiyonların ve pD2 değerlerinin diabetik İMA ve SV'de bunların kontrollerine oranla değişmediği saptanmıştır. Elde ettiğimiz sonuçlar kontrol İMA ve SV'de NA'nin maksimal kontraktil etkisinin, intakt endotel hücreler tarafından anlamlı olarak suprese edildiğini buna karşın diabetiklerde endotel hasarına ve/veya disfonksiyonuna bağlı olarak söz konusu supresyonun ortadan kalktığı göstermiştir, öte yandan, NIDDM'li hastalardan izole edilen İMA ve SV'lerde ET-l'in doza bağlı olarak kontraksiyona neden olduğu; bu etkinin, diabetik İMA ve SV'de bunların kontrollerine oranla anlamlı olarak arttığı ve aynı zamanda gerek NA'nin ve gerakse SV'nin SV'de İMA 'ya oranla daha potent vazokonstriktörler olduğu bulunmuştur. NIDDM'li İMA ve SV'de NA ve ET'in kontraktil etkilerinde kontrollere oranla gözlediğimiz artışın mekanizmaları, reseptör ve post-reseptör yolaklarda ortaya çıkabilecek değişimlerin birer fonksiyonu olarak değerlendirilmişlerdir. Bu çalışmada ayrıca, prekontrakte İMA 'da Ach ve histaminin endotele-bağımlı gevşemelere neden olduğu ve bu gevşemelerin NIDDM'li hastalardan izole edilen İMA 'da kontrollere oranla anlamlı olarak azaldığı saptanmıştır. Bununla birlikte, kontrol SV'de histamin ile stimüle edilen endotele-bağımlı gevşemelerinin, İMA 'da elde edilenlere oranla anlamlı olarak daha az olduğu; İMA' da endotele-bağımlı gevşeme oluşturan dozlarda histamin' in, SV'de kontraksiyona neden olduğu ve bu etkinin diabetiklerde kontrollere oranla anlamlı olarak arttığı gösterilmiştir. Bilindiği gibi İMA ve SV'ler, koroner arter bypass materyali olarak kullanılmaktadırlar. Yapılan çalışmalar, arteriel greftlerin implantasyondan sonra oluşabilecek aterosklerotik ve trombotik komplikasyonlara venöz greftlere oranla daha dayanıklı olduklarını ve 196endotel fonksiyonları sayesinde vazospazm oluşumuna karşı koruyucu bir rol üstlendiklerini ortaya koymuştur, bu çalışmada, NIDDM'li hastalardan izole edilen İMA ve SV'nin NA ve ET-l'e yanıtverebilirliğinin nondiabetiklere oranla artması ve agonistler ile stimüle edilen endotele-bağımlı gevşemelerin ise anlamlı olarak azalmış olması, operasyondan sonraki yaşam sürecinde koroner dolaşıma uyum sağlaması ve graft fonksiyonlarının normal koşullarda devam ettirilmesi açısından önemlidir. Kaldı ki çalışmamızda diabetik İMA' ya oranla diabetik SV'de agonistlerin kontraktil etkilerinin daha fazla arttığı ve endotele- bağımlı gevşemelerin ise dramatik olarak azaldığı saptanmıştır. Bu nedenle, İMA ve SV de yaptığımız çalışmaların sonuçları, NIDDM'li hastalarda koroner bypas materyali olarak kullanılan SV'de postoperatif erken dönemde vazospazm oluşma riskinin, İMA 'ya oranla daha fazla olduğunu ortaya koymaktadır.

SUMMARY `The Role of Endothelial Cells on the Alterations of Vascular Reactivity Induced by Different Models of Diabetes Mellitus` Alterations in the reactivity of blood vessels to neurotransmitters and circulating hormones have been suggested to cause or contribute to some cardiovascular complications, such as hypertension, that are associated with dibates mellitus. In this study, we aimed to investigate diabetes mellitus- induced alterations on vascular reactivity and role of endothelial cells. For this reason, 6-7 week old male rats weighing 150-250 g were made `insulin-dependent (Type-1) diabetic` with single tail vein injection of alloxsan monohydrate (50mg/kg), dissolved in physiological saline. Age matched control rats were injected with the same physiological saline. On the other hand, `noninsulin dependent (Type-2) diabetes was induced according to the method described by Weir et al. Two-day old male albino rat pups were injected i.p with 100 mg/kg alloxan monohydrate. Age- matched control rats recived physiological saline solution alone. Insulin dependent diabetic rats and their age-matched controls were killed after a lapse of 6-7 weeks. Noninsulin-dependent diabetic rats and their age matched controls were killed after a lapse of 11-12 weeks. Thus, both groups of diabetic rats and their age-matched controls were 13-14 weeks of age on the day of sacriface. Some of the rats with Type-1 and Type-2 diabetes were treated with insulin (4U/kg/day) for 15 days. 24 to 48 hours after alloxan treatment, rats demonstrated some of the characteristics of insulin-dependent (Type-1) diabetes and these characteristics are shown in Table-4,1. However, alloxan treatment of two-day-old neonatal rats resulted in a diabetic state similar with many aspects of noninsulin dependent diabetes (Type-2). The general features of these rats and their appropriate controls are listed in Table-4.2. In the present study, we investigated the responsiveness to different agonists of thoracic aorta obtained from Type-1 and Type-2 diabetic rats and age-matched controls. Cumulative dose-response curves to NA were obtained in each aortas with and without endothelium. In these experiments, we demonstrated that NA induced contractions in all aortas in a dose-dependent fashion. The maximum response to NA was significantly increased in Type-1 diabetic aortas with endothelium compared with those from controls. Removal of the endothelium also resulted in a significant increase in the maximum response of control and Type-1 diabetic aortas. The maximum response of Type-1 diabetic and control aortas to NA were not significantly different in the absence of endothelium. In addition, the pD2 values of control and Type-1 diabetic aortas to NA were not significantly altered in the presence and absence of endothelium. Type-1 diabetes-induced alterations on the responsiveness of aorta to NA were significantly restored with insulin treatment. On the other hand, similar to Type-1 diabetes, the maximum response of Type-2 diabetic aortas with endothelium to NA was significantly increased compared to those from controls with endothelium. However, removal of the endothelium from Type-2 diabetic aortas caused no increase in the maximum contractions produced by NA. Furthermore, no significant change was observed between the contractile responses of both Type-2 and control aortas to NA after the removal of endothelium. No change was obserwed in the pD2 values of aortas fromeither untreated or insulin- treated uiabetic rats compared with controls. In this study, we have also demonstrated that Ach, methacoline, histamine, ATP and insulin elicited dose-dependent relaxations of the precontracted aortas from control and diabetic rats. These responses were significantly increased in Type-1 diabetic rat aortas when compared to controls. On the other hand, the relaxations elicited by these agonists were strongly depressed in Type-2 diabetic aortas compared to correspondig controls. In addition, dose-dependent relaxations produced by A-23187 and SNP, an endothelium- independent substance, in aortas from both Type-1 and Type-2 diabetic rats showed no alteration compared to their corresponding controls. Our results obtained from diabetic rat aortas with NA, are consistent with previous reports showing that arteries from alloxan or STZ-diabetic rats are more responsive to the contractile effect of NA than arteries from control animals. Since the increase in tension of aortas from diabetic rats in response to NA found in the present investigation occured in the absence of any change in sensitivity (pD2 value) to NA, it is likely that an increase in the density of alpha-adrenoceptors in aorta from diabetic rats. The mechanisms involved in producing the changes in the reactivity of aorta from diabetic rats to NA, are probably linked to the post- receptor alterations. There may be an alteration in the coupling of alpha-adrenoceptors to the mobilization of calcium. The enhanced phosphoinositide metabolism in diabetic aorta in response to NA may be responsible, at least in part, for the increased contractile responsiveness of the tissues to this agonist. The enhancement of the contractile response of aorta to NA in Type-1 diabetic rats may be due to the attenuation of the spontaneous release of EDRF through an impairment of functions of endothelial cells. However, the mechanism for the enhanced reactivity to NA in Type-2 diabetes is likely to involve morphological damage at the level of the endothelium. The factors responsible for producing the increased vascular reactivity observed in diabetic aortas are not known clearly. In this study, we have also demonstrated that, NA caused dose- dependent contractions in IMA and SV rings with and without endothelium obtained from nondiabetic controls and noninsulin-dependent diabetic patients. The maximum response to NA and sensitivity (pD2) of diabetic vessels to NA in the presence of endothelium were significantly increased when compared with nondiabetic controls. In addition, the maximum responses and pD2 values of diabetic IMA and SV to NA in the absence of endothelium were not significantly different from those obtained in the presence of endothelium. The magnitude of the increase in the maximum contractile responses and pD2 values of aortas to NA produced by removing the endothelium were very similar in nondiabetic controls and diabetic vessels. These results suggest that NA caused contractions were significantly inhibited in rings with endothelium obtained from nondiabetic patients. On the other hand, contractile response to ET-1 was found to be enhanced in IMA and SV obtained from noninsulin-dependent diabetic patients undergoing coronary artery bypass surgery compared to those from nondiabetic controls. However the pD2 values and maximum responses to ET-1 were significantly increased in diabetic human IMA and SV relative to controls. In addition, we have also observed that, NA and ET-1 were more potent vasoconstrictor agents in human SV rings than human IMA. However the enhanced phososphoinositide metabolism observed in diabetic IMA and SV, in response to NA and ET-1 may be responsible atleast in part for the increased contractile responses of these tissues to the agonists. It is possible that the enhanced phososphoinositide metabolism found in the diabetic vessels is related to increased phosospholipase-C activity and/or increased alpha-adrenoceptor affinity and/or density in these vessels. Alternatively in view of the recent hypothesis that G-protein is involved in the coupling of receptors to phosospholipase-C activation. It is possible that increased G-protein activity could be linked to alterations observed in diabetic vessels. Although the vascular endothelium has been reported to modulate phososphoinositide turnover in vascular smooth muscle. Thus, the increase of contractile responses to NA and ET-1 of human diabetic vessels may be the result of disfunction or injury of endothelium. In the present study, we have also found that relaxation of the precontracted human IMA rings obtained from nondiabetic patients were specifically depressed in response to the edndothelium-dependent relaxing subtances Ach and histamine, whereas dose-response curves to SNP exhibited no change. Histamine was a potent stimulus to release of EDRF in human IMA while histamine evoked contractions in SV and this response to histamine were markedly greater in diabetic human SV than that obtained from nondiabetic patient. Several explanations have been provided for abnormal endothelium-dependent responses in diabetic human vessels. These include decreased or abnormal production and transport of EDRP; destruction of EDRF due to intimal barrier or free oxygene radicals whose levels are significantly increased in diabetic vessels. Also the decrease of endothelium-dependent relaxations to agonists of diabetic vessels may be due to the increased release of a constricting factor such as ET-1. As a matter of fact, serum ET-1 levels significantly greater in diabetic patients than normal subjects has been established recently. On the other hand, alterations in Ach and histamine receptor density on endothelial or smooth muscle cells may be involved and it is also likely that these defects on endothelial function may be related to abnormalities of endothelial cell-receptor- second messenger interactions. However, increase of contractile response of the diabetic human vessels to agonists may be, at least in part, due to an increased influx of extracellular calcium through the VOCs and/or ROCs; open- time or open-probability or density of the VOCs and/or ROCs may be increased in the diabetic vessels. In patients with coronary artery disease, IMA and SV are extensively used as by pass grafts. It is previously reported that, arterial coronary artery bypass grafts have a higher patency and lower patient mortality than venous grafts. It is most likely that, impairment of response of vascular endothelium to several vasoactive agents may be primary causes of vein graft spasm. Altered endothelium-dependent relaxing responses to several agonists and changes in response to NA and ET-1 in IMA and SV obtained from noninsulin-dependent diabetic patients that we have observed in this study, appear to be very important for graft function and patency. Endothelium-dependent relaxations to Ach and histamine are much more pronounced in diabetic IMA than in diabetic SV. In fact, contractions produced by NA and ET-1 in diabetic SV were found to be dramaticaly higher than in diabetic IMA. For this reason, our results thus strongly suggest that, when SV is used as vascular graft for coronary occlusive disease of noninsulin-dependent diabetic patients, spasm may occur more frequently early on after implantation.