Ventrikül kasılmasında oksidan stresin rolünün elektrofizyolojik olarak incelenmesi

Abstract

93 6. ÖZET Günümüzde gittikçe artan önemle fizyoloji laboratuvarlannda yer alan bilgisayarlar, real-time ve on/off-line programlar aracılığıyla hem deney otomasyonunu, herm de fizyolojik sinyallerin saklanmasını ve analizlerini gerçekleştirmektedir. Çevireçler (transducer) aracılığıyla fizyolojik sinyaller elektriksel sinyallere dönüştürülebilmekte, analog/dijital çevireçler aracılığıyla ise, bu sinyaller bigisayarlara aktanlabilmekte veya bilgisayar aracılığı ile biyolojik sistemlere istenilen sinyaller uygulanabilmektedir. Yukarıdaki bilgilerin ışığı altında, selenyumun kalp kası kontraksiyonlan üzerindeki etkisini incelemek amacıyla bir deney düzeneği kurulmuştur. Uyarılmış ve/veya spontan kas kontraksiyonlannı monitörize etmek, kaydetmek ve analiz etmek üzere, MSExp adlı, genel amaçlı bir yazılım gerçekleştirilmiştir. Selenitin papiller kas kontraktilitesine olan etkilerini incelemek için, stimulator aracılığı ile bilgisayar tarafindan tetiklenerek kontraksiyonlar elde edilmiş ve yerdeğiştirme çevireci ile elektriksel sinyallere dönüştürülerek, 1 kHz örnekleme ile bilgisayara aktarılmıştır. Papiller kasa, 10'5, 10`4, 10`3 ve 3.3xl0`3 M konsantrasyonlarda selenit uygulanarak, kontraktilitenin parametrik ve zamansal değişimleri incelenmiştir. 10`5 M selenit, papiller kasta hiçbir etki oluşturmazken, 10`4 M konsantrasyondan itibaren belirlenebilir gerim değişiklikleri gözlenmiştir. Başlangıç (kontrol) gerimine göre, papiller kas toplam geriminde, ilk 5 dakikada pozitif inotropi (%118±12) gözlenirken, 20 dakikalık uygulama sonucunda yerini negatif inotropiye (%89±9) terk etmiştir (bifazik etki). Dinlenim geriminde ise S. dakikadan itibaren başlayan monofazik bir artış, 20 dakikalık uygulama sonucunda giderek artmıştır (%110±9). Selenit konsantrasyonunun 10`4 M dan, 10`3 M a arttırılmasıyla bu etkiler daha da belirginleşmiş, toplam gerim ilk S dakikada kontrol değerine göre %126±12 artarken (pozitif inotropik etki), 20 dakika uygulama sonunda başlangıç değerine göre oldukça azalmıştır (%36±15; negatif inotropik etki). Dinlenim gerimi ise o, 3 %168±18 artarak, papiller kasta kontraktür gelişmeye başlamıştır. 3.3x10` M selenit uygulaması ise bu kontraktürü daha da belirginleştirmiştir. 5. dakikadaki pozitif inotropi ile toplam gerim %146±10 artarken, 20 dakika sonunda ise bu gerim değeri, kontrol değerinin %10±8 ine kadar düşmüş, dinlenim geriminin de başlangıç değerine göre %190±12 artmasıyla kasılma hemen hemen durmuştur. Yıkama ile değişmeyen selenyuma bağlı bu etkilerin tersinmez olduğu görülmüştür. 0.016 Hz, 0.1 Hz ve 1 Hz uyan frekansları kullanılarak, selenitin bu bifazik etkilerinin uyarılma frekansından bağımsız olduğu gösterilmiştir. Ancak, düşük sıcaklık ve SITS (4-acetamido-4'-94 isothiocyanotostillbene-2,2'-disulfonic acid) etkisinde selenitin etkilerinin %90 engellenmesiyle, selenitin hücre içerisine anyon kanallarından girerek etkisini oluşturduğu düşünülmüştür. DTT (dithiothreitole) uygulaması sonucunda selenitin etkilerinin yaklaşık %80 iyileştirilebilmesi de bize, selenitin hücre içi protein thiollerini ve diğer sülfihidril bileşiklerini okside edebildiğini düşündürmüştür. Selenitin sıçan ventrikül hücreleri üzerindeki etkilerini araştırmak için, kalp kası kontraksiyonunda önemli rol oynayan Ca-kanal akımını (Ica) incelemek üzere, whole-cell patch-clamp sistemi kurulmuştur. Hücreyi stimüle ederek Ica kaydeden, monitörize eden ve on/off-line analizlerini gerçekleştiren PCSoft adlı bir yazılım geliştirilerek sistemin otomasyonu sağlanmıştır. Mikrokapiller tüplerin ısıtılarak manyetik bir çekici ile çekilmesiyle patch elektrotları hazırlanmış ve bu elektrotlar ile izole tek ventrikül hücrelerine mikroskop altında yapışıldıktan (seal) sonra, elektrot altında kalan küçük hücre membranı parçalanarak, hücre içi ortam ile temas sağlanıp, whole-cell patch-clamp (WCPC) konfigürasyonu oluşturulmuştur. WCPC konfigürasyonunun elde edilmesinden sonra, hücre, kurulan kapiller perfüzyon sistemi ile hücre dışı ortama eşdeğer çözelti (kontrol çözeltisi) ile perfüze edilmiş, çözeltiye eklenen TTX ile Na+ kanalları, CsCl ile de K+ kanalları bloke edilmiştir. Hücreler, -70 mV dinlenim potansiyeline kenetlendikten sonra, 0 mV genliğinde 200 ms süreli test pulslarla uıyanlarak, Ca-kanal akımı (Ica) elde edilmiştir. Akımların aktivasyon ve inaktivasyon zaman sabitleri belirlenmiş, Ca-kanallannm I-V değişimi, inaktivasyonu ve reaktivasyonu ölçülerek, kanal kinetikleri ortaya çıkarılmıştır. Daha sonra, kontrol koşullarında belirlenmiş olan bu kanal ve akım parametreleri, 10`4 ve 10`3 M selenit perfuzyonu altında tekrarlanmıştır. Selenitin etkisi ile Ica genliğinde gelişen azalma, 10`4 M selenit etkisinde %14.43±6.24 ve 10`3 M selenit etkisinde ise %21.50±7.53 olarak hesaplanmıştır. Yüksek konsantrasyondaki selenit uygulaması (10`3 M), Ica genliğinde belirgin bir düşüşe neden olurken, Ica aktivasyon zamanlarını ve inaktivasyon hızlarını etkilememiştir. Ayrıca Ca-kanal kinetikleri (I-V, inaktivasyon ve reaktivasyon) üzerinde de istatiksel olarak anlamlı düzeylerde belirgin değişiklikler gözlenmemiştir (p > 0.05). Bir iz element olan selenyumun, memelilerde önemli bir besin olduğu uzun yıllardan beri bilinmektedir. Selenyum eksikliğinde, birçok patalojilerin yanısıra kardiyomiyopatinin de gelişebildiği gösterilmiştir. Selenyum eksikliğinde ortaya çıkan pekçok hastalığın önlenmesinde, selenyumun çeşitli bileşiklerinin suplementasyonuna başvurulduğu, yine de hastalıkların önlenmesinde uygulanacak olan selenyumun kimyasal formu ve dozu hakkında tartışmaların olduğu birçok çalışma vardır. Selenyumdan çok zengin diyetle beslenmiş hayvan deneyleri sonucunda, selenyum-toksisitesinin görülmüş olması da, selenyum suplementasyonunun riskini ortaya çıkarmaktadır.95 Hem selenyum eksikliğinin, hem de toksisitesinin neden olduğu patolojilerin mekanizmaları henüz tam olarak belirlenememiştir. Ancak; selenyum eksikliğinde anti-oksidan savunma sisteminin bozulması, fazlalığında ise thiol oksidasyonu sonucu serbest radikal üretiminin artması yoluyla, her iki durumun da hücre hasarına yol açabildiği görüşleri destek bulmaktadır. Anahtar Kelimeler: Sinyal analizi, kontraksiyon, Ca-akımı, tüm-hücre patch-kenetleme, papiller kas, ventriküler miyosit, selenit, yazılım.

96 7. SUMMARY THE ROLE OF OXIDANT STRESS ON VENTRICULAR CONTRACTION BY ELECTROPHYSIOLOGICAL METHODS. Computers that exist with improving priority in physiology laboratories facilitate the automation of experiments as well as the storage and analyses of physiological signals by the performance of real-time and on/off-line dedicated custom softwares. Physiological signals converted to electrical signals by transducers can be transferred into computers via analog to digital converters (ADC) or inversely, digital electrical signals generated by computers can be applied to physiological systems via digital to analog converters (DAC). In the above view of computers role in physiology, an automated experiment system has been setup to investigate the effect of selenium on heart muscle contractions and a multipurpose software named MSEXP has been developed to monitor, store and analyze the stimulated and/or spontaneous contractions. Papillary muscle contractions were evoked by a stimulator which is triggered by PC and transduced into analogous electrical signals by a displacement transducer. Elicited signals were converted to digital data with 1 kHz sampling rate via a programmable ADC to examine the effect of selenite. Contraction parameters and time domain variation of contractions were analyzed at 10`5 M, 10`4 M, 10`3 M or 3.3x1 0`3 M selenite concentrations and control conditions. While no effect was observed at papillary muscle with 10`5 M selenite concentration, significant tension alterations developed at 10`4 M and higher concentrations of selenite. 10`4 M selenite exposure induced a transient positive inotropic effect in the total tension (%1 18±12 of control) within the first 5 minutes following the exposure and turned into a negative inotropic effect (%89±9 of control) after 20 minutes exposure (biphasic effect). Meanwhile, a gradual increase in resting tension developed in the first 5 minutes and continued to increase until the end of the 20 minutes of selenite exposure (%1 10±9 of control). Increasing selenite concentration from 10`4 to 10`3 M yielded considerable increase in the effects of selenite. While the positive inotropy in total tension increased upto %126±12 of control in the first 5 minutes, the negative inotropy declined downto %36±15 of control at the end of 20 minutes of exposure. Also the resting tension increased %168±18 of its initial value and a contracture type alteration started to develop in papillary muscle. By application of 3.3x1 O`3 M selenite, the contracture type alteration in papilary muscle became more significant.97 The total tension increased %146±10 of its initial value with positive inotropy in the first 5 minutes and declined downto %10±8 of its initial value after 20 minutes following the exposure. On the other hand, the resting tension increased upto %190±12 of control and the contractions almost vanished. Washout of selenite in papillary muscle did not reversed the negative inotropic effects. Stimulating papillary muscle preperations with 0.016 Hz, 0.1 Hz or 1 Hz electrical stimulations demonstrated that, the observed alterations in contractions at different selenite concentrations were independent of stimulation frequency. However, application of SITS (4-acetamido-4'-isothiocyanotostillbene-2,2'-disulfonic acid) and lowering the experimental temperature (22°C) prevented both the positive and the negative inotropic effects as %90 suggesting selenite uptake into cardiac cells occurs through anion channels. Also the restoration of selenite effects as %80 by DTT application following selenite exposure implies that selenite can react intracellularly with protein thiols and other sulfhydryl compounds. To investigate the effect of selenite on rat heart ventricle myocytes, a whole-cell patch-clamp system was setup to examine Ca-channel currents (lea) which have a major role in heart muscle cell contractions. A software named PCSoft was developed to automate the whole patch- clamp experiment system which stimulates the myocytes and records, monitors and analyses Ica on/off-line. Patch electrodes were prepared by pulling heated microcapillary tubes with a magnetic puller. Whole-cell patch-clamp (WCPC) configurations were obtained by sealing the cardiac cells with patch electrodes under inverted microscope and by rupturing membrane patches under the sealed tip of electrodes which permitted to contact with the interior of the cell. Once the WCPC configuration was obtained, cell was exposed to desired extracellular solution by positioning the cell at the extremety of one of six capillary perfusion tubes. Na+ and K+ channels blocked by addition of TTX and CsCl into extracellular solution. To monitor Ica, cells were depolarized from -70 mV holding potential to 0 mV for 200 ms every 4 s with a patch- clamp amplifier. Kinetics of le* were analyzed by determining activation and inactivation time constants (slow, fast) of current traces, besides ion transfer characteristics (channel kinetics) of Ca-channels (I- V relationship, inactivation and reactivation curves). The kinetic analyses determined under control conditions mentioned above were then compared with the data obtained from 10`4 M and 10'3 M selenite perfused cells. The decrease in the amplitude of Ica in the presence of 10`4 M and 10`3 M selenite were98 %14.43±6.24 and %21.50±7.53 respectively. Although high concentration of selenite (10`3 M) caused a significant decrease in the amplitude of lea, it did not effect the activation and the inactivation time constants of Ca-currents. No significant alterations were developed either on I-V relationship, inactivation or reactivation of Ca-channels (p>0.05) even by high selenite exposure. Selenium, as a trace element, has been known as an essential nutrient in mammalians since years. Development of numerous pathologies as well as cardiomyopathy has been demonstrated in the deficiency of selenium. Although, selenium is being supplemented in the treatment of pathologies depending on selenium deficiency, there are some contradictory results about the optimum dose and convenient chemical form of selenium to treat the deficiency diseases. Experimentally observed selenium toxicity in selenium deficient animals fed with selenium-rich diet indicated the risk of selenium supplementation. Yet, the mechanisms of some pathologies induced by selenium deficiency or toxicity have not been clearly defined. However, the results about the impairment of anti-oxidant defending mechanisms in selenium deficiency and the increase of free radicals production as a result of thiol oxidation by high selenium highly support that both the deficiency and toxicity can cause distinctions in cell. Key words: Signal analyses, contraction, Ca-current, whole-cell patch-clamp, papillary muscle, ventricular myocytes, selenite, software.