Deneysel spinal kord travma modelinde rituksimabın nöroprotektif etkisinin immünhistokimyasal ve elektron mikroskobik yöntemlerle incelenmesi

Abstract

Spinal kord hasarlı (SKH) olguların yaklaşık yarısında sebep trafik kazalarıdırve ciddi morbiditeye neden olmaktadır. SKH‟nın tedavisine yönelik çalışmalarözellikle travma sonrası sekonder mekanizmaları önlemeye yöneliktir ve bugünekadar pek çok farmakolojik ajan denenmiştir. Ancak tüm bunlara karşın etkin bir ilaçklinik kullanıma girememiştir.Son yıllarda bir sekonder mekanizma olan nöroinflamasyon konusundayapılan çalışmalar dikkati çekmektedir ve SKH‟da antiinflamatuar ajanların,nörolojik iyileşmede anlamlı katkı sağlayabileceği öngörülmüştür. Pek çokotoimmün nörolojik hastalıkta görülen nöroinflamatuar mekanizmalara benzerşekilde, SKH sonrası nöral dokuda B-lenfositlerin ilk haftada lezyon bölgesindegörüldüğü ve müteakip olarak salınan IL-1, IL-6 ve TNF-α gibi sitokinlerin lezyonbölgesindeki sitotoksik hasarda rol oynadığı gösterilmiştir.Bu çalışmada klip kompresyonu ile sıçan SKH modelinde, bir monoklonalantikor ajan olan rituksimabın, antiinflamatuar etkisinin nöroprotektif olup olmadığıaraştırıldı. İnflamatuar sitokinlerden IL-1β, IL-6 ve TNF-α‟ya spesifik antikorlarındışında, B-lenfosit işaretleyicisi olan CD20 antikoru ile immünhistokimyasal veelektron mikroskobik inceleme yapıldı.Materyal ve MetotBu çalışmada 24 adet Wistar-albino erkek sıçan kullanıldı. 1. grupta 8 adetsıçana laminektomi yapıldı. 2. grupta 8 adet sıçana laminektomi sonrası 1 dakika klipkompresyonu ile SKH oluşturuldu. 3. grupta SKH oluşturu1ması sonrası rituksimabtedavisi verildi. Bu gruba rituksimab 0. gün (travma ile eş zamanlı), 3. gün ve 5. gün 55intraperitoneal olarak toplam 3 doz uygulandı. Sıçanlar 7. günün sonunda sakrifiyeedildi. Perfüzyon sonrası SKH‟lı doku örnekleri alındı. Tespit sonrası ELISA kitikullanılarak IL-1β, IL-6, TNF-α ve CD20 antikorları ile immünhistokimyasal veelektron mikroskobik olarak incelendi.BulgularElektron mikroskobik incelemede özellikle otofagozomların yoğun olarakgözlendiği fagositik süreçte oligodendrositlerden zengin bulgular SKH‟lı dokuörneklerinde hakimdi. SKH‟nın oligodendrositlerde fagositik hücreleretransformasyonunu hızlandırdığı belirlendi. Rituksimab tedavisi ile SKH sonrasıgörülen miyelin dejenerasyonuna ait bulgularda iyileşmeye ek olarakoligodendrositlerin normal yapıda oldukları gözlendi. Bu bulgu, rituksimabuygulamasının fagositik süreci baskıladığını, ancak miyelinli sinir rejenerasyonundayetersiz kaldığını göstermiştir.İmmünhistokimyasal incelemede SKH‟lı doku örneklerinde TNF-αekspresyonunun arttığı ve rituksimab uygulaması sonrası tamamen baskılandığısaptandı. Ayrıca rituksimab tedavisi ile SKH‟lı grupta nöral dokuda CD20ekspresyonunda azalma ilacın nöral dokuda B-lenfosit invazyonuna etkili olduğunugösterdi. Ek olarak IL-1β ve IL-6‟nın travma ile glial destek hücrelerindeekspresyonunun arttığı ancak rituksimab tedavisiyle herhangi bir değişiklikoluşmadığı gözlendi.SonuçSKH‟da, özellikle oligodendrositlerde belirgin olmak üzere tüm nöronal veglia hücrelerinde TNF-α ekspresyonunun arttığı ve rituksimab uygulaması ile isetamamen baskılandığı saptandı. Ayrıca rituksimab tedavisi ile SKH‟lı grupta görülenCD20 ekspresyonunda azalma, hem nöronal hem de nöronal olmayan destek dokudasaptanmış olup bu nöral iyileşme ile ilişkili olabilir

Traffic accident is the most frequent reason for spinal cord injury (SCI).Morbidity of SCI is a major social and medical problem. Studies against treatment ofSCI mainly focus on prevention of secondary mechanisms after SCI and manypharmacological agents were under trial. Despite all these advancements, a definitivetreatment agent for SCI was not provided yet.Neuroinflammation is a major secondary mechanism after SCI. Studieswithin the last decade focus on antiinflammatory agents and these agents wereaccepted to be beneficial for neural healing. B-lymphocytes were noted at the injurysite within the first week after SCI and subsequent secretion of cytokines like IL1,IL6 and TNF-α play a major role in cytotoxic cell damage. This mechanism wassimilar to neuroinflammatory cell damage which is a significant mechanism forautoimmune neurological diseases.In this study, we investigate anti-inflammatory and effects of rituximab, anew generation monoclonal antibody agent, on rat SCI with clip compression.Rituximab was presumed to be neuroprotective and specific antibodies (ELISA)against CD20, a marker for B-lymphocytes, were studied with electronmicroscopeand immunohistochemistry. Specific antibodies against cytokines like TNF-α, IL-1βand IL-6 were also studied.Material and Methods24 male Wistar albino rats were used for the study. Rats were divided into 3groups at random and 8 rats in group 1 (sham) were subjected to thoraciclaminectomy. Clip compression of thoracic spinal cord was performed on 8 rats for 1minute in group 2. Eight rats in group 3 were subjected to same clip compression and 57three separate intraperitoneal rituximab administration on days 0, 3 and 5 in the thirdgroup. Rats in all 3 groups were sacrified on day 7 after perfusion and spinal cordsamples were collected from the injured cord segment. Antibodies against IL-1β, IL-6, TNF-α and CD20 were studied with ELISA method together withelectronmicroscopic analysis.ResultsOligodendrocytes at phagocytic stage were noted with characteristiccytoplasmic autophagosomes on spinal cord sections. This was thought to be due toincreased phagocytic transformation of oligodendrocytes. Degenerative findings ofmyelin after SCI were markedly improved and oligodendrocytes were almost normalin appearance in group 3 under rituximab treatment. This finding showed rituximabto suppress phagocytic stage but still inefficient for regenerative phase.TNF-α expression was markedly increased in rats subjected to SCI andsuppressed after rituximab treatment. Decreased CD20 expression was a prominentfinding in rats under rituximab therapy and this finding showed the drug waseffective in suppression of B-lymphocyte invasion. Furthermore, expression of IL-1βand IL-6 were increased in glial cells without significant change after rituximabadministration.Discussion and ConclusionTNF-α expression was augmented at the level of SCI particularly inoligodendrocytes as well as both neuronal and glial cells. These findings weresuppressed after rituximab administration. Besides, rituximab reduces CD20expression both in neuronal and supportive glial cells which may be related to neuralhealing