Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ile plazma homosistein ölçümümü ve klinik uygulamaları

Abstract

ÖZET Bu çalışmada hastanemiz koşullarında kesinliği, duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek olarak bilinen Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) tekniği kullanarak, plazma homosistein ve diğer tiyollerin miktar tayinini yapmayı amaçladık. Bu amaçla HPLC ile floresan detektörün kullanıldığı bir yöntemi modifiye ederek kullandık. Bu yöntemde ilk önce, tiyoller 0.1 M p-mercaptoethanol ile redükte edilerek 7- fluoro-2,1,3-benzoxa sulfonamide (ABD-F) ile türevlendirildi. Daha sonra %20 lik TCA ile deproteinize edilen örnekler sisteme enjekte edildi. Ters-faz elusyon kullanılarak tiyollerin ayrıldığı bu yöntemde mobil faz olarak %8 metanol içeren fosfat tampon (pH=6.0) kullanıldı ve izokratik elüsyon şeklinde sisteme uygulandı. Kolon olarak C « (ODS) (150x4.6 mm) kolonun kullanıldığı bu yöntemde, dedektörün eksitasyon dalga boyu 386 nm, emisyon dalga boyu ise 516 nm olarak ayarlandı. Önce, 4 tiyolün (homosistein, sistein, sisteinil-glisin ve glutatyon) bulunduğu kanşım halindeki standartlar, daha sonra da bilinmeyen örnekler ile çalışılarak, en uygun yöntem verileri elde edildi. Buna göre, her bir tiyolün ayn ayrı piklerinin belli tutunma zamanlarında elde edildiği saptandı. Kromatogramda ilk pik olarak sistein (RT=299±20 saniye), son pik olarak da glutatyona (RT=600±30 saniye) ait olan pikler alındı. Homosistein piki ise 413±25 saniyede elde edildi. Yöntemin kesinlik çalışmalannda, gün içi CV %1.96 ve günler arası CV %4.34 olarak bulundu. Homosistein, sisteinil-glisin ve glutatyon için.yöntemin 0-100 jımol/L, sistein için ise 0-400 nmol/L konsantrasyonları arasında lineer olduğu saptandı. Sağlıklı erkekler (n=25, 20-45 yaş) için plazma total homosistein konsantrasyonu 11.69+2.32 nmol/L (ortalama+S.D.) ve sağlıklı kadınlar (n=21, 20-46 yaş) için 9.45±1.78 fimol/L (ortalama±S.D.) olarak ölçüldü. İki grup arasında istatiksel olarak anlamlı farklılık bulundu (P=0.002). Ayrıca her iki grupta da total homosistein ile serum vitamin B12 ve folik asit arasında negatif bir korelasyon olduğu bulundu 44

SUMMARY In the present study, our aim was to assess and develop the method to determine the plasma total homocysteine and other thiols levels by using the High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) known as the method with high precision, sensitivity and specificity. We modified a method to determine the plasma total homocysteine and other thiols concentration by using the HPLC-Fluorescence Detector. Firstly, the thiols were reduced with 0.1 M p-mercaptoethanol and derivatized with 7-fluoro-2,1,3-benzoxa sulfonamide (ABD-F). Then the samples were deproteinized by 20% TCA and then they were separated efficiently by reversed-phase elution with the C « (ODS) (150x4.6 mm) column. In this assay, phosphate buffer (pH=6.0), containing 8% methanol as mobile phase was used in isocratic elution mode. Detector values were 386 nm wavelength for excitation and 516 nm wavelength for emission applied. The method was performed by studying the mixed standard of 4 thiols. According to data, each peak of the individual thiols was obtained in given retention times (RT). The first peak was for cysteine (RT=299±20 second) and the last one for glutathione (RT=600±30 second) in the chromatogram. The peak of homocysteine was obtained at the 413±25 second. Mean within-run and between-run precisions were determined to be 1.96% CV and 4.34% CV, respectively. Detection limit was found to be linear up to 100 fimol/L for homocysteine, cysteinyl-glycine and glutathione, and 400 jımol/L for cysteine. Plasma total homocysteine concentrations determined in healthy men (n=25, 20-45 years old) and healthy women (n=21, 20-46 years old) were 11.69+2.32 and 9.45±1.78 ymoUL (mean±S.D.), respectively. The differences in total homocysteine between sexes were statistically significant (P=0.002). Serum vitamin B12 and folic acid inversely correlated with total homocysteine in both sexes. 45