LDL'nin izolasyonu, okside edilmesi ve oksidasyonunun moniterize edilerek oksidatif direncinin incelenmesi

Abstract

ÖZET Serbest radikaller yüksek reaktiviteleri nedeniyle biyolojik sistemlerde çok kısa ömürlüdür. Serbest radikallerin bu özellikleri ve değişken yapılan doğrudan ölçümlerini ve miktarlarının belirlenmesini güçleştirmektedir. Bu nedenle araştırıcılar serbest radikal reaksiyonlarının ürünlerini ölçmeye yönelmişlerdir. Özellikle lipid peroksidasyonlan üzerine bu çalışmalar yoğunlaşmıştır. Oksidatif olarak modifiye olmuş LDL'nin ateroskleroz patogenezinde rol aldığı görüşü sebebiyle, çalışmalar LDL'nin oksidatif modifikasyonu üstüne yönelmiştir. Oksidasyon esnasında lipoprotein molekülünün kompozisyonu hızla değiştiğinden, kinetik ölçümler önem kazanmıştır. İnvitro LDL oksidasyonunu izlemede en sık başvurulan yöntemler, TBARS ve konjuge dien ölçümüdür. TBARS, fotometrik ve fluorometrik ölçülebilmektedir. Fotometrik ölçümünün duyarsızlığı, fluorometrik ölçümün zorluğu konjuge dien ölçümünü tercih sebebi yapmaktadır. LDL'nin invitro oksidasyonu metal iyonları katalizörlüğünde yapılabilmektedir. +2 Oksidasyon için fizyojik pH'daki fosfat tampon ve Cu ile inkubasyon uygun +2 olmaktadır. Ortamdaki hidrojen peroksitten, Cu katalizörlüğünde hidroksil radikali oluşur. Bu radikal, lipid molekülündeki çiftli doymamış karbon atomundan hidrojen bağı kopararak (oksidasyon) lipid peroksil radikallerini oluşturur. Lipid peroksil radikalleri komşu lipidlere saldırır. Antioksidanlar tükenene kadar reaksiyon çok yavaştır. İlerleme fazına girildiğinde reaksiyon birden hızlanır. Bu yöntemde reaksiyonun takibi, okside olan lipid moleküllerindeki bir tür iç düzenleme ile gelişen dien oluşumunun 234 nm'de izlenmesiyle dolaylı olarak yapılır. Reaksiyonun bitiminden sonra konjuge dienler azalmaya başlar; zira bu moleküller kararsızdır ve daha sonra bir kısım reaktif aldehitlere ve gazlara dönüşmektedir. İzolasyonundan, oksidasyonun izlenmesine kadar bir çok basamakta pek çok denemeler yaparak yöntem üzerinde çalıştık. Sonuçta, (var olan olanakların da artması ile) daha sonra klinik bir takım araştırmalara temel olacak şekilde, LDL oksidasyonu; oksidasyonun monitorizasyonu ve bu yolla oksidatif direnci ölçülmeyi başardık. 40

SUMMARY LDL ISOLATION, OXIDATION AND ASSESSMENT OF OXIDATIVE RESISTANCE BY MONITORING THE OXIDATIVE PROCESS Since free radicals are highly reactive, they have very short half life in biological systems. This property and unstable structure make direct measurement of free radicals are difficult. Due to this reason, all investigators has been trying to measure the products of free radical reactions. Especially, measurement of lipid peroxidation is getting more important. The oxidative modification of LDL is suggested to play an essential role in the pathogenesis of atherosclerosis. As the structure of LDL changes rapidly during oxidation, kinetical measurement of LDL become more popular. TBARS and conjugated diens measurement, are used to evaluate invitro LDL oxidation. TBARS can be measured by photometrically or fluorometrically. Because of insensivity of photometric method and difficulties of fiuorometric method; measurement of conjugated diens is preferred frequently. Invitro LDL oxidation is a transition metal catalyzed reaction. Incubation with +2 Cu and physiologic phosphate buffer is necessary for oxidation. Hydroxil radicals are produced from hydrogen peroxide. These radicals break the double bonds in unsaturated lipid molecules and produced lipid peroxide radicals. The radicals start to attack other lipid molecules. The reaction is very slow till all the antioxidants run out. In propagation phase, reaction is gets more rapid. In this study, measurement of LDL oxidation was measured continously by monitoring the change in 234 nm dien absorption. At the end of reaction, conjugated diens start to fall. Due to their unstable structure, they convert to reactive aldehydes and gases. We made some experiments for every step of this method. At the result, being basis for further clinical studies, we succeeded the continous monitorization of LDL and to measure the oxidative resistance. 41