Tüm antibiyotiklere dirençli klebsıella pneumonıae mikroorganizmasına karşı otolog trombin ile aktive edilen trombositten zengin plazmanın ın vıtro antimikrobiyal etkinliğinin araştırılması

Abstract

Bu çalışmada, Sultan Abdülhamid Han Eğitim ve Araştırma Hastanesi Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvarı'nda izole edilen Tüm Antibiyotiklere İlaç Direncine sahip (TAD) K. pneumoniae izolatı üzerinde, trombositten zengin plazma (TZP)'nin in vitro etkinliğinin ortaya konulması amaçlanmıştır. Bu etkinin aynı zamanda antimikrobiyal duyarlılık testleri için uygulama standartlarında belirtilen kolay üreyen bakterilerde standart suş olan E. coli ATCC 25922 ile GSBL doğrulama testi yapılırken rutin olarak kullanılması önerilen K. pneumoniae ATCC 700603 suşlarına antimikrobiyal etkilerinin kıyaslanması planlandı.Çalışmamıza katılan 10 gönüllünün her birinden alınan 54 ml tam kandan MagellanPRP™ kitiyle 3 ml TZP ve 20 ml trombositten fakir plazma (TFP) elde edildi. Eş zamanlı olarak aynı bağışçılardan alınan kan örnekleri %10 kalsiyum glukonat ile etkileşime sokulduktan sonra çeşitli santrifüj aşamalarına tabii tutularak otolog trombin elde edildi. Otolog trombin ile aktive edilen TZP'nin, son bakteri konsantrasyonu 1x103 kob/ml olan TAD'e sahip K. pneumoniae izolatı üzerindeki antimikrobiyal etkinlikliğinin ortaya konulması amacıyla 1., 2., 4., 8. ve 12. saatlerde %5'lik Koyun Kanlı Agar yüzeyine ekim yapıldı. TZP'nin TAD'e sahip K. pneumoniae üzerine 1., 2., 4., ve 8. saatlerdeki üreyen koloni sayıları kontrol grubuna göre kıyaslandığında antimikrobiyal etkinliğin 1. saatte başladığı 2. saatte tepe noktasına ulaştığı, 4. saatteki etkinliğin 2. saatteki etkinliğe yakın olduğu bu etkinliğin 8. saatte de devam ettiği bulundu. Antimikrobiyal etkinin 12. saatte kaybolduğu görüldü. 1., 2., 4., ve 8. saatlerdeki transforme edilmiş üreme ortalamalarının farkları istatiksel olarak anlamlıydı(p<0.05).Aynı şekilde TZP'nin E. coli ATCC 25922 üzerine antimikrobiyal etkisinin 2. saatte tepe noktasına ulaştığı, 8. saatte bu etkinliğin azaldığı, 12. saatte ise kaybettiği görüldü. K. pneumoniae ATCC 700603 suşunda ise TZP etkinliğinin 2. saatte tepe noktasına ulaştığı, 4. saatteki etkinliğin 2. saatteki etkinliğe yakın olduğu, 8. saatte etkinliğin azalarak devam ettiği ve 12. saatte ise kaybettiği görüldü. Her iki ATCC suşu için bu etkinlikler 8. saate kadar istatistiksel olarak da anlamlıydı.Bu çalışmada TZP'nin her üç bakteri üzerine de etkinliğinin olduğu ayrı ayrı gösterildi. İlk saatlerde etkinliğin her üç bakteri üzerine de aynı olduğu ve sayımlarda elde edilen farkların istatistiksel olarak anlamsız olduğu bulundu. Bu durum, çalışmamızda kullanılan gram negatif enterik bakteriler üzerinde TZP'nin bakteri türü ve direnç durumu gözetmeksizin antimikrobiyal etkinlik yaptığı olarak değerlendirildi.Salt olarak antimikrobiyal direncin etkisini değerlendirmek amacıyla TAD'e sahip K. pneumoniae ve K. pneumoniae ATCC 700603 karşılaştırıldı; TZP'li gruplarda 8. saatteki TAD'e sahip K. pneumoniae üreyen koloni sayısının daha az ve bu üreme azlığının istatistiksel olarak anlamlı olduğu bulundu. Bu ise bakteri direnci arttıkça trombositlere hassasiyetin artabileceğini düşündürdü. Trombositlerin trombin ile aktivasyona uğratılması ile tüm antibiyotiklere dirençli bakteriler de dahil olmak üzere, lokal enfeksiyonların tedavisinde yardımcı bir hücresel kan bileşeni olarak kullanılabileceğini düşünmekteyiz. Fakat bunun için geniş katılımlı randomize kontrollü in vitro ve in vivo çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.

In this study, it was aimed to investigate the in vitro activity of thrombocyte rich plasma (PRP) on K. pneumoniae isolate (PDR) with all antibiotic drug resistance isolated in Sultan Abdülhamid Han Training and Research Hospital Medical Microbiology Laboratory. This activity was also planned to be compared to E. coli ATCC 25922, the standard strain for easy breeding bacteria, as specified in the application standards for antimicrobial susceptibility testing, and K. pneumoniae ATCC 700603, which is routinely recommended for use in the ESBL validation test.We obtained 3 ml of PRP and 20 ml of platelet poor plasma (PPP) from a 54 ml whole blood obtained from each of 10 volunteers who participated in our study with the MagellanPRP ™ kit. Simultaneously, blood samples taken from the same donors were subjected to various centrifugation steps after the interaction with 10% calcium gluconate and autologous thrombin was obtained.5% Sheep Blood Agar surface seeding was performed at 1, 2, 4, 8, and 12 hours to demonstrate the antimicrobicidal activity of autologous thrombin-activated PRP on PDR K. pneumoniae isolate with a final bacterial concentration of 1x103cfu/ml.When the number of colony forming on PRP of PDR K. pneumoniae at 1st, 2nd, 4th, and 8th hours is compared to that of the control group, antimicrobial activity reaches the peak at the 2nd hour starting at the 1st hour, the activity at the 4th hour is close to the activity at the 2nd hour and this activity continued at 8th hour. It was seen that the antimicrobial activity disappeared in the 12th hour. The differences in the mean transformed reproduction at the 1st, 2nd, 4th and 8th hours were statistically significant (p<0.05).Likewise, the antimicrobial activity of PRP on E. coli ATCC 25922 reached its peak at the 2nd hour, decreased at 8th hour and lost at 12th hour. In K. pneumoniae strain ATCC 700603, it was observed that the PRP activity reached its peak at the 2nd hour, that the activity at 4th hour was close to the activity at 2 hours, the activity decreased at 8th hour and then disappeared at 12th hour. For both ATCC strains, this activity was statistically significant up to the 8th hour.In this study, the effect of PRP against all three bacterial strains was shown separately. In the first hours, the activity was found to be the same on all three bacteria, and the differences obtained in the counts were statistically insignificant. This was assessed as the antimicrobial activity of PRP on gram-negative enteric bacteria used in our study, regardless of bacterial strain and resistance status.PDR K. pneumoniae and K. pneumoniae ATCC 700603 were compared to assess the effect of antimicrobial resistance alone; in PRP groups, PDR K. pneumoniae at the 8th hour was less in the number of breeding colonies and this was found to be statistically significant. This suggests that sensitivity to thrombocytes may increase as bacterial resistance increases.We believe that by activating platelets with thrombin, they can be used as an adjunctive cellular blood component in the treatment of local infections, including all antibiotic resistant bacteria. However, there is a need for extensive and randomized controlled in vitro and in vivo studies for this.