Kan kültürlerinden soyutlanan acınetobacter baumannıı suşlarında per-1 tipi genişlemiş spektrumlu beta laktamaz varlığının araştırılması ve RAPD PCR yöntemi ile klonal yakınlığının incelenmesi

Abstract

6.1. AMAÇBu çalışmada; Selçuk Üniversitesi Meram Tıp Fakültesi Hastanesinde hastaların kan kültürlerinden izole edilen A.baumannii izolatlarından seftazidime dirençli suşlarda PCR yöntemi ile PER-1 tipi GSBL enzimatik genlerinin varlığının araştırılması ve PER-1 geni taşıyan A.baumannii izolatları arasında RAPD-PCR moleküler yöntemi ile hastane ortamındaki genotipik ilişki çıkartılarak hastane içerisindeki tür yakınlığının saptanması amaçlanmıştır.6.2. GEREÇ ve YÖNTEMÇalışmaya kan kültürlerinden izole edilen Acinetobacter baumannii suşları alınmıştır. Bakteri identifikasyonu konvansiyonel yöntemler ve Phoenix 100 BD Otomatize Sistemi (Becton Dickinson Diagnostic Systems, Sparks) kullanılarak yapılmıştır. Seftazidim direnci E test yöntemi ile belirlenmiştir. Seftazidim dirençli suşlarda DNA izolasyonu için Qiagen DNA ekstraksiyon kiti (QIAGEN, United Kingdom) kullanılmıştır. PER-1 geninin varlığı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile araştırılmıştır. Polimeraz zincir reaksiyonu, daha önceden tanımlanmış olan PER-1 gen bölgesine komplementerini amplifiye eden PER1-F ve PER1-R primerleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Amplifikasyon ürünleri %2 agaroz jelde 100 V'da 1 saat yürütüldükten sonra etidyum bromid ile boyanan jeldeki PER-1 genine ait bantlar UV ışık altında GelDoc sistemi yardımıyla görüntülenmiştir. PER-1 pozitif A. baumannii suşlarının genetik olarak birbirlerine yakınlıkları Random Amplified Polymorphic DNA-PCR (RAPD) yöntemi ile M13 primeri (5'-GAGGGTGGCGGTTCT-3') kullanılarak yapılmıştır. Amplifikasyon ürünleri %2'lik agaroz jelde 100 V'da 1saat ve 50 V'da 1 gece yürütüldükten sonra jeldeki bant görüntüleri UV ışık altında GelDoc görüntüleme sistemi yardımıyla bilgisayar ortamına aktarılmıştır. Bant büyüklükleri kullanılarak veriler kümeleme analiz yöntemi ile Gel Compar II (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium) programı kullanılarak dendogramı yapılmıştır.6.3. BULGULARE test yöntemi ile 100 suşun 78'i (%78) seftazidime dirençli bulunmuştur. 78 adet seftazidim dirençli suşun PCR analizine göre 18 (%23)suşta PER-1 geni saptanmıştır. RAPD yöntemi ile 18 adet PER-1 pozitif suşun klonal ilişkisine bakılmıştır. Bantlar arasındaki benzerlikler `dice smilarity coefficients`'e göre hesaplanmış ve PER-1 pozitif tüm suşlar birbiri ile ilişkili bulunmuştur.6.4. SONUÇÇalışmamızda daha önce yayınlanan verilerden daha düşük oranda PER-1 pozitifliği saptanmıştır. Ancak çalışmamızdaki suşların çoğunun seftazidime dirençli olması, bu suşlarda farklı direnç genlerinin varlığını düşündürmektedir. PER-1 varlığı saptanan suşların RAPD analiz yöntemi ile klonal ilişkisini araştırdığımızda, farklı kliniklerde klonal ilişkili suşların saptanması, hastaların zaman zaman aynı servislerde yatmasına bağlı olabilir ve bu bulgular servisler arası yayılım olabileceğini düşündürmektedir.

In this study, the presence of PER-1 type ESBL was investigated in caftazidime resistant A.baumannii strains isolated from bloodstream infections by PCR and also the clonal relatedness of the isolates was investigated by random amplified polymorphic DNA (RAPD) in all PER-1 producing A.baumannii strains.7.2. MATERIALS and METHODSA.baumannii strains isolated from bloodstream infections was included in this study. The isolates were identified as A.baumannii by conventional methods and Phoenix 100 BD automated System system (Becton Dickinson Diagnostic Systems, Sparks). Ceftazidime resistance was determined by E-test method. For DNA extraction from ceftazidime-resistant A.baumannii, Qiagen DNA extraction kit (QIAGEN, United Kingdom) was used. PER-1 genes were screened by PCR. For PCR; PER1-F and PER1-R primers were used. Genetic relatedness of PER producing A.baumannii is investigated with RAPD by using M13 primer (5?-GAGGGTGGCGGTTCT-3?). PCR products were electrophoresed in a 2% agarose gel and stained with ethidium bromide (Bio-Rad). Gels were scanned and the images captured by a Gel-Doc-2000 Gel Documentantion System. Data analyses were performed using Gel Compar II (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium).7.3. RESULTSOf the 100 A.baumannii isolates; 78 (78%) were determined as ceftazidime-resistant by E-test method. Among the 78 ceftazidime-resistant A.baumannii isolates the PER-1 gene was identified in 18 (23%) isolates. The clonal relatedness of the 18 PER-1 positive isolates were investigated by random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. The similarity of the bands were calculated according to `dice smilarity coefficients` and all PER-1 positive isolates were found as clonally related.7.4. CONCLUSIONIn our study the prevalence of PER-1 was lower than the previous studies. But presence of the high ceftazidime resistance rates among these isolates may indicate the presence of other beta-lactamases. Detection of clonal related isolates with RAPD analysis among different services may be because of the treatment of these patients at the same services before and this may explain the spread of PER-1 positive strains.