Clostridium sporogenes otolitik enzimlerinin Escherichia coli'de rekombinant ifade edilmesi

Abstract

Geç şişme, özellikle yüksek pH'lı, sert ve yarı-sert peynirlerde gözlenen, Clostridium cinsi üyesi bakterilerin neden olduğu ve peynir endüstrisinde ekonomik kayıplara neden olabilen, en önemli fermentasyon kusurlarından biridir. Peynirin olgunlaşması esnasında karbondioksit ve hidrojen gibi gazların ortaya çıkması sonucunda peynir matrisi genellikle ortaya çıkan gazın basıncına dayanamamakta ve peynir yapısında gözenekler, çatlaklar ve yarıklar oluşabilmektedir. Bu gazlara ek olarak ortaya çıkabilen bütirik asit ve asetik asit gibi metabolitler istenmeyen, anormal peynir aromasına da sebep olabilmektedir. Son yıllarda ülkemiz süt sanayiinde kaşar peyniri üretiminde önemli sayıda geç şişme sorunu ile karşılaşılmakta ve bazen bu durum kaşar peynirinin raf ömrü içerisinde şiştiğine yönelik şikayetler ile tüketicilere de doğrudan yansıyabilmektedir. Çiğ süte uygulanan baktofügasyon işlemiyle bakteriyel sporların azaltılması, lizozim ve nisin gibi katkı maddelerinin kullanılması ve koruyucu starter kültür kullanımı gibi yöntemler bu soruna yönelik çözüm geliştirme amacıyla uygulanıyor olsa da sorunun tamamen çözüldüğünü söylemek güçtür ve bu yöntemlere çeşitli alternatiflerin geliştirilmesi gerekmektedir. Bu tez çalışmasının amacı, türe özgü ve özellikle Gram pozitif bakterilerde etkili olan otolitik enzimlerin peynir üretimindeki en önemli bozulma etkenlerinden biri olan Clostridium suşlarının inhibisyonu üzerindeki litik etkisini inceleyerek peynirlerde yaşanan geç şişme sorununun çözülmesine katkıda bulunmaktır. Bu kapsamda, yerel kaşar peyniri örneklerinden izole edilmiş Clostridium sporogenes hücrelerinin genomunda bulunan, spor korteks litik enzimi (SleB) ve D-alanil-D-alanin Karboksipeptidaz (CRB) isimli 2 otolitik enzim ilk defa klonlanmış ve E. coli konakçısında ifade edilmiştir. Çalışma sonucunda, rekombinant otolitik enzimlerin C. sporogenes suşları üzerinde kısmi inhibisyonu gözlemlenmiş olup, daha ileri çalışmalarla bu enzimlerin aktivitesinin geliştirilebileceği ve peynircilikte yaşanan geç şişme sorununa karşı alternatif olarak kullanılabilme potansiyelinin olduğu belirlenmiştir.

One of the most significant fermentation defects, late blowing is caused on by bacteria of the genus Clostridium and is most frequently seen in hard and semi-hard cheeses with high pH levels. It can cause economic losses for the cheese industry. The production of gases like carbon dioxide and hydrogen as the cheese ripens generally causes the cheese matrix to be unable to withstand the pressure of the gas, leading to pores, cracks, and crevices in the cheese's structure. Along with these gases, certain metabolites like butyric acid and acetic acid might also result in an unfavorable, atypical cheese flavor. Kaşar cheese production in our nation's dairy industry has encountered a significant number of late blowing concerns in recent years. Occasionally, this scenario can be directly reflected in consumer complaints that cheddar cheese swells before it expires. Although techniques like bactofugation, which reduces bacterial spores in raw milk, the use of lysozyme and nisin as additives, and the use of protective starter cultures have been used to develop solutions for this issue, it is difficult to say that the problem has been fully resolved. Various alternatives to these techniques should therefore be developed. By analyzing the lytic effect of the autolytic enzymes, which are site-specific and particularly effective in Gram-positive bacteria, on the inhibition of Clostridium strains, one of the most significant deterioration factors in cheese production, the goal of this thesis study is to contribute to the solution of the late blowing problem in cheese. This thesis describes the first cloning and expression of two autolytic enzymes from the genome of Clostridium sporogenes cells isolated from local Kaşar cheese samples: spore cortex lytic enzyme (SleB) and D-alanyl-D-alanine Carboxypeptidase (CRB).The study revealed a partial inhibition of recombinant autolytic enzymes on C. sporogenes strains, and it was concluded that additional research might increase the activity of these enzymes and potentially replace the late blowing issue in cheese production