Investigation of transneuronal degeneration in traumatic injury and neurodegenerative diseases

Abstract

Bu çalışmada, çeşitli hücre tiplerinde Parkinson hastalığı (PH), Huntington hastalığı (HH) ve travmatik yaralanma dâhil olmak üzere farklı nörodejeneratif hastalık modelleri ve bunların transnöronal dejenerasyon modeli olarak kullanılabilirliği değerlendirilerek olası nörokorunma mekanizmalarını araştırdık. PH modellemesinde iki paradigma kullandık: yabani tür veya mutant α-sinükleinin aşırı anlatımı anlamlı bir hücre ölümüne neden olmazken 6-OHDA uygulamasının SH-SY5Y ve LUHMES hücrelerinde hücre ölümünü indüklediği doğrulandı. 6-OHDA uygulamasının SH-SY5Y ve LUHMES hücrelerinde Parkinson benzeri toksisiteye sebep olduğunu doğruladık. Bu in vitro PH modeli kullanılarak uygulanan ilaç yeniden konumlandırma yaklaşımı, Quercetin ve Rutin'in ön tedavisinin, hem SH-SY5Y hem de LUHMES hücrelerinde 6-OHDA ile indüklenen PD modelinde nöroprotektif olduğunu ortaya koydu. Ek olarak, Elk1 aşırı anlatımının, Quercetin ve Rutin ile aynı gen yollarını etkileyerek nöroprotektif olduğunu gösterdik. In vitro HH modelinin oluşturulması için, HEK293T hücrelerinde ve birincil nöronlarda yabani tür ve mutant Huntingtin (mHtt) proteininin aşırı anlatımı sağlandı. mHtt agregatlarının, HEK293T hücrelerinde çoğunlukla sitoplazmik, nöronlarda ise nükleer agregasyonlar oluşturduğunu gözlemledik. Ayrıca mHtt agregatlarının F-aktin ile birlikte biriktiği gösterildi. Buna ek olarak, Elk1'ın fosfo mutantlarının aşırı anlatımının mHtt agregasyonunu azaltması sadece PH'da değil, HH'da da nöroprotektif bir etkiye sahip olabileceğini gösterdi. Uzun süreli canlı görüntüleme, aşırı mHtt anlatımı bulunan nöronlar ölse bile mHtt agregatlarının ortamda kaldığını ve muhtemelen çevredeki sağlıklı nöronlarda toksisiteye neden olduğunu ortaya koydu. Bu bulgular, in vitro HH modelinde TND'nin varlığını doğruladı. Ayrıca, kalsiyum görüntülemesi yapılan hücrelerde PH veya HH indüklenmesi ile nöronlarda mHtt anlatımı bulunmasa da senkronize ve yüksek frekanslı kalsiyum aktivitesi gözlendi. In vitro ve in vivo tek hücre aksotomileri, tek bir nörondaki hasarın, PH ve HH ındakine benzer bir şekilde çevredeki nöronlarda senkronize bir kalsiyum aktivitesini ve çevredeki sağlıklı nöronların ölümünü tetiklediğini ve bunun P2X7 ekspresyonu bulunmayan hücrelerde anlamlı ölçüde azaldığını ortaya çıkardı.

In this study, we implemented different neurodegenerative disease models including Parkinson's disease (PD), Huntington's disease (HD) and traumatic injury in varied cell types, assessed their feasibility as a model for studying transneuronal degeneration, and investigated possible neuroprotection mechanisms. In modelling PD, we used two paradigms: while overexpression of wild type or mutant α-synuclein did not cause significant cell death in SH-SY5Y and LUHMES cell lines, induction of cell death was confirmed upon 6-OHDA treatment. We confirmed that 6-OHDA treatment induces Parkinsonian toxicity in SH-SY5Y and LUHMES cells. Using this in vitro PD model, a drug repositioning approach revealed that pretreatment of Quercetin and Rutin is neuroprotective in 6-OHDA induced PD model in both SH-SY5Y and LUHMES cells. We further shown that Elk1 overexpression is neuroprotective through the same gene pathways as Quercetin and Rutin. In order to establish the in vitro HD model, we overexpressed wildtype vs mutant Huntingtin (mHtt) protein in HEK293T cells and in primary neurons. We observed that mHtt formed mostly cytoplasmic aggregates in HEK293T cells and nuclear aggregates in primary neurons. We found that localization of mHtt aggregates coincided with accumulation of F-actin. Additionally, we found that overexpression of phosphomutants of Elk1 decreases mHtt aggregation, indicating it can have a neuroprotective effect not only in PD but also in HD. Long term monitoring revealed that mHtt aggregates are not degraded even if mHtt overexpressing neurons died and possibly cause toxicity to surrounding healthy neurons. This has confirmed the presence of TND in in vitro HD model. Besides, time lapse calcium imaging revealed that in vitro induction of either PD or HD resulted with synchronized calcium activities with higher frequencies in neurons, even the cells do not express mHtt themselves. In vitro and in vivo single cell axotomies further revealed that injury in a single neuron triggers a synchronized calcium activity similar to observed in PD or HD and death of surrounding healthy neurons which is significantly decreased in P2X7 knockout cells.