Plant suspension culture derived extracellular vesicles

Abstract

Her ne kadar ekstraselüler veziküller (EVler) her canlı hücrede gözlemleniyor olsa da, memeli olmayan canlıların EVleri üzerindeki çalışmalar, insan EV çalışmalarına göre çok daha kısıtlı kalmıştır. Günümüzde bitkisel EVler üzerine yapılan ilk çalışmalar kanser, kolit, bağışıklık sistemi hastalıkları ve yara kapanması gibi alanlarda umut vadedi sonuçlar göstermektedir. Fakat, bitkisel EV alanında hala çok sayıda bilgi eksikliği bulunmaktadır. Alandaki yayınların büyük bir kısmı uluslararası EV araştırma standartları ve tanımlarına uymamaktadır. Çalışmaların bulguları, kullanılan kaba izolasyon metotlarından dolayı örneklerinde bulunan çok sayıdaki kirlilik, yetersiz kontroller, ve eksik karakterizasyonlardan dolayı şüphelidir. Bu sorunlar, bitkisel EVler için bilimsel camia tarafından kararlaştırılmış bir izolasyon veya biyomarker olmadığı için daha şiddetli hissedilmektedir.Bu tezle bu sorunlara çözüm olarak, bitki hücre süspansiyon kültürleri ile gerçek bitkisel EVlerin izolasyon ve karakterizasyonunu sağlayan bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntem ile from Nicotiana tabacum, Vitis vinifera ve Stevia rebaudiana hücrelerinden EVler izole ve karakterize edildi. N. tabacum EVleri üzerinde yapılan proteomiks çalışma ile yedi bitkisel EV biyomarker adayı tanımlandı. Ayrıca, N. tabacum ve yedi ayrı bitkisel EV proteomu, insan EVlerinde en sık görünen proteinler ile ortolog keşfi için karşılaştırıldı. 116 insan ortholoğu olan bikti protein tanımlandı, bu proteinlerin 24'ü en az beş bitkide gözlemlendi.Bulgularımız bitki hücre süspansyon kültürlerinin yüksek saflıkta bitkisel EV üretimi için kullanılabileceklerini kanıtlamaktadır. Bitkisel EVlerin kolay ve efektif şekilde üretilen terapötik ajanlar veya ilaç taşıyıcılar olarak kullanımları yüksek potansiyel taşımaktadır. Ayrıca bu çalışmada tanımlanan biyomarkerler bitkisel EV alanında başka çalışmaların yolunu açabilir.

Although extracellular vesicles (EVs) are an ever-present part of life, research of non-mammalian EVs have been severely limited compared to the studies of human EVs. Initial studies of plant EVs already report promising results, such as therapeutic effects for various types of cancers, colitis, immunomodulation, and wound healing. However, there are still many unknowns in plant EV research. A large majority of the articles published in the field fail in adhering to the standards and definitions set in international guidelines of EV research. The abundant contaminants created due to the harsh isolation procedures, lack of adequate controls, and incomplete characterization of the isolated EVs makes these findings questionable. The issues are exacerbated due to a lack of a plant EV isolation method or biomarkers agreed upon by the scientific community.This dissertation attempts to address this issue by providing a complete workflow for the isolation and characterization of true plant EVs using plant cell suspension cultures. Using this workflow, we have isolated and characterized EVs from Nicotiana tabacum, Vitis vinifera and Stevia rebaudiana cell cultures. Proteomic analysis of N. tabacum sEVs revealed the presence of eight proteins suggested as plant EV biomarker candidates. Furthermore, we ran an ortholog protein discovery analysis using proteomes of N. tabacum and seven other plant EV proteomes against top human EV proteins. We identified 116 human proteins with plant orthologues, with 24 of these proteins being present in more than five or more plants.Our findings prove that plant cell suspension cultures can be used for the production of highly pure plant EVs. Plant EVs have considerable potential as therapeutic agents or drug delivery devices, which can be easily, and efficiently produced in a large scale manner. Finally, the biomarkers identified in this study can pave the way for future studies in the field of plant EV research.