Production of enzymes for food industry via solid state fermentation and optimization of process conditions

Abstract

Enzimler biyokimyasal reaksiyonları in vivo ya da in vitro hızlandıran, canlı hücrelertarafından üretilen biyokatalizörlerdir. Yiyecek, kağıt, deterjan ve ilaç gibi bir çokendüstriyel alanda kullanılırlar. Bir asit proteaz olan aspartik proteaz ve transglutaminaz,süt, et, bira ve şarap endüstrilerinde kullanımı açısından önemli enzimlerdir. Limitli GRASdoğal suşu olması ve düşük hücre dışı APaz ve TGaz üretimi bu alandaki rekombinant üretimçalışmaları için destek noktasıdır. Iyi bilinen bir heterolog protein üreticisi olan Pichiapastoris, bu enzimlerin rekombinant ifadesi için iyi bir alternatiftir. Üreticinin önemidışında, fermantasyon süreci de enzim üretiminin iyileştirilmesinde anahtar roloynamaktadır. Neredeyse serbest su yokluğunda yapılan katı faz fermantasyonu yüksekprotein üretim oranı sağlamasıyla basit ve ucuz bir yöntem olarak değerlendirilir. Ancak katıfaz fermantasyonu uygulamasında, sistemin heterolog doğasından kaynaklanan sıcaklık vepH'nın sabit tutulması, oksijen tüketiminin geliştirilmesi gibi zorluklar vardır.Bu tezdeki çalışmalar, moleküler çalışmalar, biyoproses çalışmaları ve üretilen enzimlerinyiyecek sektörü ürünlerinde uygulanması şeklinde gruplanmıştır. Moleküler bölümünde,tasarlanan aspartik proteaz ve transglutaminaz genleri de novo sentezlenip klonlanarakmetanol tarafından indüklenebilen gen ifade sistemi oluşturulmuştur. Koloni doğrulandıktansonra, batık kültür ve katı faz fermantasyonları yapılıp büyüme hızı, üretim verimi, oxsijentüketim ve methanol buharlaşma hızları açısından karşılaştırma yapılmıştır. Optimumkoşulların bulunabilmesi için fermantasyonlar modifiye edilmiş reaktörlerde cebrihavalandırma ve karıştırma uygulanmıştır. Üretilen enzim farklı gıda ürünlerinde testedilmiştir. Katı faz fermantasyonunun rekombinant enzim üretimi için gelecek vaat ettiği vebatık kültür fermantasyonuna göre oksijen alım hızının daha yüksek olduğu gösterilmiştir.Karmaşık besi yeri kullanıldığında iki rekcombinant enzim de başarılı bir şekilde üretilmiştirancak kimyasal bileşimi tanımlı besi yeri kullanıldığında ise sadece katı fazfermantasyonunda yüksek titrede elde edilebilmiştir.

Enzymes are biocatalysts, accelerating biochemical reactions in vivo or in vitro, with a widerange of applications in different industries like food, feed, detergent, paper, andpharmaceuticals. Aspartic protease, an acid protease, and Transglutaminase are importantenzymes for the food industry, like milk, meat, brewery, and wine industries. Limited GRASnative strain and low extracellularly produced APase and TGase, makes the research forrecombinant alternatives imperative. Pichia pastoris a well-known yeast host forheterologous protein production is a good alternative for recombinant expression of theseenzymes. Once the production host is selected, the determination of fermentation steps is thekey in enzyme production. Solid-state fermentation (SSF), which is performed in the nearabsence of free water is considered to be a cheap and simple process with high protein titers.Despite being a promising process option, SSF presents several challenges, primarilybecause of its heterologous nature, e.g., maintaining fermentation temperature and pHconstant, enhancing oxygen consumption, and homogeneous nutrient distribution.Addressing these challenges constitutes the main theme of this thesis.This thesis covers molecular work, optimization of production via SSF of the two targetenzymes, and application of these in various food processes. The molecular work covers thedesign, de novo synthesis and cloning, and construction of methanol inducible system withP. pastoris as host. Once the host is obtained, a series of submerged (SmF) and solid-statefermentation (SSF) were conducted to comparatively analyze growth and production yieldsas well as oxygen consumption and methanol evaporation rates. To find optimum conditions,SSF in a modified reactor with forced aeration and forced stirring were performed. Theproduced enzyme is tested in the different food products. SSF process is verified to bepromising conditions for recombinant enzyme production, during which high cell densityare reached. A higher oxygen uptake rate was proved by results compared with SmF. Bothrecombinant enzymes were successfully expressed when the complex medium was used.While, when the defined medium was used the production was in good titer only in the SSFprocess.