Comparison of enzymatic and non-enzymatic isolation methods for menstrual blood mesenchymal stem cells in maintenance of stemness

Abstract

Endometrium, rahmin iç kısmında yer alan ve embriyo için zemin sağlayan ince bir epitel tabakadır. Endometrium tabakası her ay gebelik için embriyoya uygun hale gelir, gebelik olmadığı durumlarda adet ile dökülür ve endometriyal tabakayı tekrar gebeliğe hazırlar. Endometriyal tabakada endometriyal mezenkimal kök hücrelerin (eMKH) varlığı, menstrüel kanda (MK-MKH) kök hücre olasılığını beraberinde getirmiştir. MK-MKH'leri tanımlayan çalışmalar, bu hücrelerin mezenkimal kök hücre özellikleri gösterdiğini ve dolayısıyla izolasyon kolaylığı nedeniyle klinik çalışmalarda kullanılma potansiyeline sahip olduğunu belirtmiştir. Literatürde MK-MKH'lerin izolasyonunda farklı yöntemler kullanılmış olmasına rağmen, bu izolasyon yöntemlerinin hiçbiri kök hücre özelliklerini koruma açısından bugüne kadar karşılaştırılmamıştır. Bu bağlamda, bu tezin amacı, enzimatik olmayan, kolajenaz tip 1 ve ikili sindirim yöntemi olmak üzere üç farklı izolasyon yöntemini karşılaştırmak ve menstrüel kandan izole edilen MKHlerin geç pasajlara kadar kök hücre özelliklerini koruma potansiyelini araştırmaktır. İzolasyon yöntemleri karşılaştırıldığında hücre morfolojisinde herhangi bir farklılık gözlenmemiştir. Benzer şekilde, akış sitometrisi ile yüzey belirteçlerinin analizi, kök hücre özelliklerinin erken ve geç pasaj MK-MKH'lerinde korunduğunu ve izolasyon yöntemleri arasında bir fark olmadığını gösterilmiştir. MK-MKH'lerin koloni oluşturma özelliği açısından, üç izolasyon yöntemi arasında erken pasajda en iyi izolasyon yönteminin ikili sindirim izolasyon yöntemi olduğu belirlenmiştir. WST-1 testi kullanılarak hücre büyüme hızı analiz edildiğinde erken pasaj hücrelerinde en iyi izolasyon yönteminin enzimatik olmayan yöntem olduğu görülmüştür. Bununla birlikte, geç pasaj için kaydedilen çoğalma oranındaki azalma, elde edildikleri izolasyon yönteminden bağımsız olarak tüm MK-MKH'lerde belirgin olarak tespit edilmiştir. Sonuç olarak, literatürde ilk kez, MK-MKH'lerin izolasyon yöntemleri kök hücre özellikleri açısından karşılaştırılmış ve sonuçlarımız enzimatik olmayan yaklaşımın en iyi izolasyon yöntemi olarak önermiştir.

Endometrium is a thin epithelial layer located on the inside of the uterus and provides the ground for the embryo. Endometrium layer becomes suitable for the embryo every month for pregnancy, sheds with menstruation in cases where there is no pregnancy and prepares the endometrial layer for the pregnancy again. Presence of endometrial mesenchymal stem cells (eMSCs) in the endometrial layer brought about the possibility of stem cells in the menstrual blood (MenSCs). Early studies that identified MenSCs stated that these cells showed mesenchymal stem cell characteristics and hence possessed potential to be used in clinical studies due to their ease in isolation. Although different methods were employed in the isolation of MenSCs in the literature, up to now none of these isolation methods have not been compared in terms of preserving the stem cell properties. In this context, the purpose of this thesis is to compare the three different isolation methods including non-enzymatic, collagenase type 1 and dual digestion method and investigate the potential of MSCs isolated from menstrual blood to maintain their stemness until late passages. No difference in cell morphology was observed when the isolation methods were compared. Similarly, analysis of surface markers by flow cytometry showed that stem cell characteristics were preserved in early and late passage MenSCs and there was no difference between the isolation methods. In terms of colony forming feature for MenSCs, cells isolated with dual digestion method demonstrated an advantage compared to the other protocols at early passage. When cell proliferation rate was analysed using WST-1 assay, it was seen that the best isolation method in early passage cells was the non-enzymatic method. However, the decrease in the proliferation rate recorded for the late passage was evident in all MenSCs regardless of the isolation method they were derived from. As a result, for the first time in the literature, isolation methods of MenSCs were compared in terms of stemness characteristics and our results suggested non-enzymatic approach as the best isolation method.