Agrobacterium-mediated transformation of Turkish sweetpotato cultivar using a marker gene

Abstract

İklim değişikliği, nüfus artışı ve artan gıda talebinin karşılanmasındaki zorluklar nedeniyle biyoteknolojik çalışmalar önem kazanmaktadır. Besleyiciliği yüksek ve sağlığa yararlı olan tatlı patates [Ipomoea batatas (L.) Lam.], tüm dünyada fonksiyonel bir gıda olarak tüketilmektedir. Türkiye'de tatlı patatese artan ilgi sonucu üretiminde artış görülmektedir. Günümüzde tatlı patates genellikle ülkenin güney kesimlerinde, ağırlıklı olarak Hatay bölgesinde yetiştirilmektedir. Yerel çeşitler ekonomik kazanç sağlamak için henüz tarımsal olarak geliştirilmemiş olmakla birlikte tatlı patateste geleneksel melezleme yöntemlerinin uygulanması zordur. Bu nedenle, transgenik bitki teknolojisi kullanılarak besin değeri yüksek, hastalıklara dayanıklı ve stres koşullarına toleranslı yeni özelliklere sahip çeşitler geliştirilebilir. Bu çalışmada, tatlı patates yerel çeşidi Hatay Kırmızı'da Agrobacterium aracılığı ile gen transferi, Agrobacterium LBA4404 suşu tarafından taşınan pCAMBIA1301 plazmidinde β-glukuronidaz (GUS) geni markör olarak kullanılarak optimize edilmiştir. Hatay Kırmızı çeşidinde boğum arası eksplantlar kullanılarak optimize edilmiş ve ortalama yüzde 79 kallus oluşturma oranı gözlenmiştir. LBA4404 suşunun büyümesi ve koloni oluşumu, YEB besiyerinde 30°C'de sağlanmıştır. Agrobacterium ile tatlı patatesin birlikte ko-kültür süresi 3 gün olarak optimize edilmiştir. Varsayılan transgenik kallus, GUS aktivitesi ve GUS geninin PCR tayini ile doğrulanmıştır. Sonuçlar, Agrobacterium aracılığı ile transformasyon başarısının genotip, eksplant yaşı, Agrobacterium suşu, bakteriyel konsantrasyon, inokülasyon süresi ve ko-kültür süresi gibi birçok faktörden etkilendiğini göstermiştir. Bilgimiz dahilinde, bu çalışma, tatlı patates yerel çeşidinde yapılan ilk bitki transformasyon çalışmasıdır ve yerel tatlı patates çeşitlerinde transformasyon çalışmaları için yeni bilgiler sağlayacaktır. Bunun yanı sıra, Türkiye'ye özgü tatlı patates çeşitlerinde viral hastalıkların üstesinden gelmek için bitki doku kültürü protokollerinin optimize edilmesi önemlidir. Çalışmanın ikinci bölümünde, 7 farklı Güney Kore tatlı patates çeşidinde mikroçoğaltım yapılmıştır. Optimize edilen mikroçoğaltım protokolü Türkiye'deki tatlı patates bitkisel gen kaynaklarının korunmasını ve gelişmiş ıslah uygulamalarında kullanılabilmesini sağlayacaktır.

Biotechnological studies are gaining importance due to climate change, population growth and the difficulties in meeting the increasing food demand. Sweetpotato [Ipomoea batatas (L.) Lam.] which is highly nutritious and beneficial for health is consumed worldwide as a functional food. In Turkey, the increasing interest in I. batatas has led to an increased production. Nowadays, sweetpotato is generally grown in the south part of the country, mainly in Hatay region. While local varieties are yet to be improved agriculturally to supply economic gain, it is difficult to perform traditional hybridization for I. batatas. Therefore, by using transgenic plant technology, it might be possible to develop varieties with desired traits including high nutritional value, resistance to diseases and tolerance to stress conditions. In this study, Agrobacterium-mediated gene transfer system in I. batatas local variety Hatay Red was optimized by using the β-glucuronidase (GUS) gene as a marker in pCAMBIA1301 plasmid carried by Agrobacterium LBA4404 strain. Calli formation from I. batatas Hatay Red internode explants were optimized with an average callus formation efficiency of 79 per cent. YEB medium was optimized at 30°C for growth of LBA4404 strain and for efficient single colony formation. The co-cultivation duration of Agrobacterium and I. batatas were optimized as 3 days. Putative transgenic calli were confirmed by GUS assay and PCR identification of GUS gene. The results showed that efficiency of Agrobacterium-mediated transformation is negatively influenced by many factors including the plant genotype, type of Agrobacterium strain, the age of explant, bacterial density, time for inoculation and co-cultivation. To the best of our knowledge, this was the first plant transformation study conducted with a Turkish I. batatas variety and has a great potential to provide new insights for transformation studies in local cultivars of I. batatas. Besides, optimizing plant tissue culture protocols are crucial to overcome viral disease problems in Turkish sweetpotato cultivars. In the second part of this study, 7 different South Korean I. batatas cultivars were micropropagated with an established protocol for future agricultural applications and biotechnological research studies.