Determination of miRNA profile and partial protein analysis in secreting exosomes from chordoma cells

Abstract

Kordoma, nadir görülen, embriyonik notokord kalıntılarından köken alan, yavaş büyüme,yüksek nüks oranı ve ilaç direnci özelliklerine sahip bir çeşit kemik tümörüdür. Kanser kökhücreleri, tümörlerin nüks etmelerini ve kanser hücrelerinin agresiflikleriniyönendirebilmektedir. Tümörküre kültür methodu, kanser kök hücrelerinin anoikis direnciile küre yapılarını oluşturmasına dayanmaktadır. Eksozomlar, kargo molekülleri olanmiRNAlar, proteinler ve lipitler aracılığıyla hücre-hücre iletişimini destekleyen hücrelerarası keseciklerdir. Çalışmamızda ilk olarak tümörküre kültürlerinin kanser kök hücrezenginleştirmesinde öncülük ettiği tespit edilmiştir. Daha sonrasında bu tümörkürelerden veparental hücrelerden eksozom izolasyonları gerçekleştirilmiş, bu eksozomlarınkarakterizasyonları NTA analizi, eksozomların yüzey tetraspaninlerinin tespiti ve akışsitometrisi vasıtasıyla yapılmıştır. Eksozom uygulamasının kordoma hücre hatlarıüzerindeki etkilerini araştırmak için hücre canlılığı, invazyon-migrasyon kapasitesi,köklülükle ilişkili gen ifadeleri ve prognostik biyobelirteç ifadeleri gösterilmiştir. Busonuçlara göre devam eden omik çalışmaları için CH22 ve JHC7 hücre hatları seçilmiştir.miRNA mikrodizin analizlerine göre hücre döngüsü, büyüme faktörü sinyal yolakları,JAK/Stat yolakları ve köklülükle alakalı yolakların kordoma kanser kök hücrelerindensalgılanan eksozomlar ile düzenlendiği tespit edilmiştir. Ek olarak, protein dizin sonuçlarınagöre içsel apoptotik yolak proteinlerinin kordoma kanser kök hücre eksozomlarında azaldığıtespit edilmiştir. Özellikle EGF sinyallerinin artışı olmak üzere birçok büyüme sinyallerinindüzenlenmesinden kordoma kanser kök hücre eksozomlarının ilişkili olabileceği tespitedilmiştir. Tüm bunlar göz önüne alındığında, bu tezin çalışmalarının tamamlanmasıyla birlikte,kordoma kanser kök hücreleri tarafından salgılanan eksozomların özellikleri ve ayrıca bueksozomların kordoma saldırganlığını tetikleyen çeşitli kargo molekülleri belirlenmiştir.

Chordoma is a slow-growing primary bone tumor that develops from embryonic notochordremnants. Although it is a rare disease, it has higher recurrence rates along with its strongresistance to conventional cancer treatments. The recurrence of tumors and theaggressiveness of cancer cells are both driven by cancer stem-like cells (CSCs).Tumorsphere culture method based on sphere formation by anoikis resistance of CSCs isused to enrich CSCs. Exosomes are small extracellular vesicles that carry proteins, lipids,miRNAs, and other cargo to support cell-cell communication. In this study, we haveestablished that enrichment of chordoma CSCs that are generated from chordoma tumorspheres. Following that, exosomes from the the parental and CSC-enriched cell lines wereisolated and characterized by exosomal surface tetraspanin determination and nanoparticlesize detection using NTA and flow cytometry analyses. The effects of exosome treatment onchordoma cell lines were investigated by using several functional assays including cellviability, invasion/migration, gene quantification for the stem-cell and other prognosticbiomarker. Based on these findings, exosomes isolated from two chordoma cell lines, JHC7and CH22 were found to be the most efficient exosomes and chosen for the omic studies.The miRNA microarray results demonstrated that exosomes secreted from chordoma CSCsare involved in the regulation of cell cycle, growth factor signaling pathways, JAK/Statpathways and stemness-associated pathways. Furthermore, protein array studies revealedthat intrinsic apoptotic pathway proteins were downregulated in chordoma CSCs-drivenexosomes. Moreover, exosomes secreted from chordoma CSCs showed to have a role in theregulation of growth factor signaling, particularly EGF pathway. Overall, based on our findings, we can conlcude that the properties of exosomes secretedfrom chordoma CSCs might be in involved in the progression of chordoma.