Identification of genomic and transcriptomic variants in chordoma cancer stem cells

Abstract

Embriyonik notokord kalıntılarından köken aldığı bilinen kordoma, nadir görülen bir kemik tümörüdür. Kordoma için güvenilir bir tedavi yaklaşımı henüz geliştirilemediğinden, kordoma patogenezinde etkili olan faktörlerin belirlenmesi, hastalığın anlaşılması ve tedavi için yeni hedefler geliştirebilmek açısından büyük önem arz etmektedir.Bu tez çalışmasında, kordoma kanser kök hücrelerindeki genomik varyantlar moleküler yolaklar incelenmiştir. Bu amaçla ilk olarak 4 farklı kordoma hücre hattında kordoma tümör küreleri, yan popülasyon hücreleri ve CD133+/CD15+ ikili pozitif kordoma hücreleri alınarak köklülük ve epitel-mezenkim geçişi işaretçilerinin ifadesi bakımından karşılaştırılmışlardır. İncelenen teknikler arasında tümörküre kültürlerinin dört hücre hattı için de zenginleştirme için kullanılabileceği tespit edilmiştir. Sonrasında kordoma tümörkürelerinde genomik varyantlar ve diferansiyel gen ifade profilleri yeni nesil DNA dizileme ve total transkriptom mikrodizin teknikleriyle belirlenmiştir. Kontrol hücrelere göre kordoma tümörkürelerinde etkilenmiş yolakların belirlenmesi ve etkilerinin değerlendirilmedi için fonksiyonel zenginleştirme analizleri gerçekleştirilmiştir. Son olarak SEMA5A, TPD52L1 ve GAPLINC genlerinin ifadeleri iki kordoma hücre hattında susturularak invazyon, göç ve canlılık üzerine etkileri incelenmiştir. Sonuçlar siRNA ile inhibe edilen TPD52L1 ifadesinin kordoma hücre hatlarında hem göç hem de invazyonu engellediğini; SEMA5A ifadesinin baskılanmasının UM-Chor1 hücrelerinin hem göç hem de invazyon yeteneklerini engellediğini, MUG-Chor1 hücrelerinin ise yalnızca invazyon kapasitesini anlamlı şekilde düşürdüğünü göstermiştir. Ek olarak, GAPLINC ifadesinin susturulması ile UM-Chor1 hattında migrasyon ve invazyon anlamlı şekilde azaldığı, ancak MUG-Chor1 hücrelerinin etkilemediği tespit edilmiştir.Bu çalışma, tümörküre kaynaklı kordoma kanser kök hücrelerinde genomik ve transkriptomik değişikliklerin incelenmesi ve TPD52L1 ile SEMA5A genlerinin kordomaların göç ve invazyon kapasiteleri üzerindeki etkisinin gösterilmesi bakımından literatürde bir ilk teşkil etmektedir.

Chordoma is a rare malignant bone tumor that originates from remnants of the embryonic notochord. Since a reliable treatment for chordoma has not yet been developed, determining the factors that contribute to the pathogenesis of chordoma is of great importance in terms of understanding the disease to develop new targets for treatment. In this dissertation study, prominent genomic variations and molecular pathways in chordoma cancer stem cells were investigated. For this purpose, initially, chordoma tumorspheres, side populations, and CD133+ and CD15+ double-positive cells were enriched in 4 different chordoma cell lines, and the obtained cells were compared in terms of expression changes in stemness and EMT marker genes. Among the techniques that were examined, the tumorsphere enrichment method was determined to be applicable for four chordoma cell lines. Then, genomic variations and differential gene expression profiles of chordoma tumorspheres were determined by next-generation DNA sequencing and total transcriptome microarray techniques. Functional enrichment analyses were used for the evaluation and determination of dysregulated pathways in chordoma tumorspheres in comparison to parental cell lines.Finally, gene expression of SEMA5A, TPD52L1, and GAPLINC genes, whose expression was found to be upregulated in tumorspheres, were inhibited in two chordoma cell lines to investigate their downstream effects on invasion, migration, and viability. Results showed that siRNA-mediated silencing of TPD52L1 significantly impairs both the migration and invasion characteristics of chordoma cell lines. Downregulation of SEMA5A inhibited migration and invasion of UM-Chor1 cells and impaired the invasive capacity of MUG-Chor1 cells. Additionally, decreased GAPLINC expression significantly reduced invasion and migration in UM-Chor1 cells, but did not affect MUG-Chor1 cells.This study constitutes a first in the literature in terms of examining genomic and transcriptomic changes in tumorsphere-derived chordoma cancer stem cells as well as demonstrating the impact of TPD52L1 and SEMA5A genes on the invasive and migrative capacity of chordoma cells.