Rosmarinic acid production from Lavandula angustifolia HEMUS and Lavandula x intermedia var. Super A species

Abstract

Bitkiler, savunma mekanizması oluşturmak için biyotik ve abiyotik faktörlere yanıt olarakbüyük miktarlarda sekonder metabolitler üretir. Günümüzde ilaç, pestisit, tatlandırıcılar,parfüm, kozmetik, renklendirici ve gıda katkı maddeleri gibi birçok endüstridekullanılmaktadırlar. Rosmarinik asit (RA), antimikrobiyal, antioksidan ve antiviral gibibirçok biyolojik aktivitede etkili olması nedeniyle özellikle ilaç ve kozmetik endüstrisi içinönemli bir ikincil metabolittir. Üretimi geleneksel olarak tarladan bitki toplamaya dayalıdır,ancak düşük verim ve mevsimsel farklılıklar gibi birçok dezavantajı bulunmaktadır. Bunedenle, çevresel değişikliklerden bağımsız olarak RA üretimi için alternatif bir yöntem olanbitki hücre süspansiyon kültürü geliştirilmiştir. Sekonder metabolit üretimi, seçici bir ajankullanılarak daha yüksek metabolit üretimine sahip hücre dizilerinin seçilmesi gibi farklıstratejiler uygulanarak daha da artırılabilir. Bu çalışmada, RA üretimini sağlamak ve dirençlihücre hatları ile verimi artırmak amacıyla iki lavanta türünden (Lavandula angustifoliaHemus ve Lavandula x intermedia var. Super A) 4 yıllık kallus hücre hatları kullanılarakbitki hücre süspansiyon kültürleri oluşturuldu. Büyüme parametreleri, ortamın yaşağırlığına, pH'ına ve zamana bağlı RA ekstraksiyonuna dayalı olarak ölçüldü. RAekstraksiyonu, farklı hacimlerde (2 ve 5 ml) ekstraksiyon çözücüsü ve farklı çözücülerle (suve yüzde 70 etanol) tekrardan seyreltilmesi ile optimize edildi. Ayrıca farklıkonsantrasyonlarda (0.4 mM, 0.6 mM, 0.8 mM) m-f-D,L-fenilalanin (MPHE) kullanılarak,daha yüksek RA üretimine sahip hücre hatları elde etmek için seleksiyon stratejisi uygulandı.Hücre yoğunluğunun (inokülasyon miktarı), hücre büyümesi ve RA üretimi üzerindeki etkiside incelendi. Hücre süspansiyon kültürünün kullanılması, seleksiyon için en iyi yöntemolarak bulundu. MPHE'ye dirençli süspansiyon hücreleri, seçilmemiş hücrelere kıyaslaönemli ölçüde daha yüksek RA üretimi (0.399 g/L) gösterdi. Ek olarak, dirençli hücrelerMPHE'nin yokluğunda muhafaza edildiğinde RA üretimi azaldı. Son olarak, her iki lavantatürünün dirençli hücrelerinden, RA oluşumunda rol oynayan LaAT1 geninin ekspresyonseviyesi, qPCR kullanılarak ölçüldü. 0.6 mM MPHE seleksiyonu altındaki dirençli Hemushücre hatlarında daha yüksek LaAT1 gen ekspresyon seviyeleri ölçüldü. Bu çalışma, Lavantatürlerinde RA üretimine dayalı gelecekteki çalışmalara temel oluşturacaktır.

Plants produce large amounts of secondary metabolites as a response to biotic and abioticfactors to create a defense mechanism. Today, they are used in many industries such aspharmaceuticals, pesticides, flavorings, fragrances, cosmetics, colorants and food additives.Rosmarinic acid (RA) is an important secondary metabolite especially for thepharmaceutical and cosmetic industry since RA is effective in many biological activitiessuch as antimicrobial, antioxidant and antiviral. Its production has traditionally been basedon harvesting plants from the field but it has many disadvantages such as low yield andseasonal variations. Therefore, plant cell suspension culture has been developed as analternative method for the RA production regardless of the environmental changes.Secondary metabolite production can be further increased by applying different strategiessuch as selection of cell lines with higher metabolite production by using a selective agent.In this study, plant cell suspension cultures from two lavender species (Lavandulaangustifolia Hemus and Lavandula x intermedia var. Super A) were established using 4 yearold callus cell lines in order to provide RA production, and increase the yield with resistantcell lines. Growth parameters were measured based on the fresh weight, pH of the media,and extraction of RA over time. RA extraction was optimized with different volumes (2 and5 ml) of extraction solvent and resuspension solvent types (water and 70 per cent ethanol).Furthermore, a selection strategy was performed in order to obtain cell lines with higher RAproduction by using m-f-D,L-phenylalanine (MPHE) in different concentrations (0.4 mM,0.6 mM, 0.8 mM). The effect of cell density (inoculation size) on cell growth and RAproduction was examined as well. Use of cell suspension culture for the selection was foundto be the best method. The suspension cells which were resistant to MPHE demonstratedsignificantly higher RA production (0.399 g/L) compared to non-selected cells. In addition,the production of RA decreased when the resistant cells were maintained in the absence ofMPHE. Finally, from the resistant cells of both lavender species, the expression of the LaAT1gene, a role in the formation of RA, was quantified by using qPCR. The resistant Hemus celllines under 0.6 mM MPHE selection showed higher LaAT1 gene expression levels. Thisstudy will be a base for the production of RA in Lavender species in further studies.